染料木素拮抗對氧磷致大鼠血管內(nèi)皮功能損傷的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：血管內(nèi)皮細(xì)胞（Vascular Endothelial Cell，VEC）是一層單層扁平上皮細(xì)胞，存在于血液與血管壁之間。血管內(nèi)皮細(xì)胞參與機(jī)體的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、凝血、免疫等多種生命活動(dòng)，合成并釋放多種血管活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)血管生理活動(dòng)。氧化應(yīng)激、炎癥、免疫應(yīng)答及毒素等多種因素可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并進(jìn)一步引起細(xì)胞功能障礙，血管壁功能損傷，引發(fā)多種心血管疾病。對氧磷（paraoxon，PO）是有機(jī)磷酸酯類農(nóng)藥在機(jī)體內(nèi)通過肝臟P450系統(tǒng)

2、代謝生成的具有生物活性的物質(zhì)，可引起機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，損傷血管內(nèi)皮，誘發(fā)心血管疾病。染料木素(genistein，GST)是主要存在于豆科植物中的一種植物雌激素，具有多酚羥基結(jié)構(gòu)，可直接發(fā)揮抗氧化作用；同時(shí)染料木素還能提高機(jī)體抗氧化酶的水平和活性，抑制NADPH氧化酶的活性，間接發(fā)揮抗氧化作用，避免或減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷，維持血管內(nèi)皮的正常功能。NADPH氧化酶最早發(fā)現(xiàn)存在于巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中，內(nèi)皮細(xì)胞中Nox4、p22p

3、hox是NADPH氧化酶的主要表現(xiàn)形式。NADPH氧化酶的主要功能是參與機(jī)體活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）的生成，調(diào)節(jié)機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　目的：探討染料木素對對氧磷誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制，為預(yù)防心血管疾病提供理論參考。
　　方法：(1)離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)檢測血管舒縮功能：取雄性SD大鼠胸主動(dòng)脈制做離體胸主動(dòng)脈血管環(huán)，測量并記錄血管環(huán)張力。實(shí)驗(yàn)分組如下：溶媒對照組：用0.1％的

4、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）預(yù)孵育血管環(huán)30 min后，檢測大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)對乙酰膽堿（acetylcholine，Ach；1×10-9～1×10-5mol/L）誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張（endothelium-dependent relaxation，EDR）功能及硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP；1×10-6mol/L）誘導(dǎo)的非內(nèi)皮依賴性舒張功能的反應(yīng)；各濃度PO處理組：分別用不同濃

5、度的PO（4.05×10-9～4.05×10-5mol/L）預(yù)孵育血管環(huán)30 min后，檢測大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)對Ach及SNP誘導(dǎo)的血管舒張功能的反應(yīng)；PO+GST處理組：分別用PO（4.05×10-6mol/L）與不同濃度的GST（1×10-9，3×10-9，1×10-8，3×10-8，或1×10-7mol/L）共同孵育血管環(huán)30min后，檢測大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)對 Ach及 SNP誘導(dǎo)的血管舒張功能的反應(yīng)及對苯腎上腺素（phenyllphri

6、ne，PE；1×10-6mol/L）誘導(dǎo)的血管收縮功能的反應(yīng)；(2)RT-PCR檢測p22phox和Nox4 mRNA的表達(dá)：取雄性SD大鼠胸主動(dòng)脈，分別用DMSO（0.1%）、GST（1×10-7mol/L）、PO（4.05×10-5mol/L）、PO（4.05×10-5mol/L）+GST（1×10-7mol/L）處理30min，RT-PCR法檢測各組p22phox、Nox4 mRNA表達(dá)的變化；(3)western-blottin

7、g觀察p22phox和Nox4蛋白表達(dá)的變化：取雄性SD大鼠胸主動(dòng)脈，處理方法及實(shí)驗(yàn)分組同(2)，觀察各組p22phox、Nox4蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：(1)離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)檢測血管舒縮功能：PO（4.05×10-9～4.05×10-5mol/L）可濃度依賴性地抑制Ach誘導(dǎo)的EDR反應(yīng)，對SNP誘導(dǎo)的非內(nèi)皮依賴性舒張功能沒有影響；GST（1×10-8，3×10-8或1×10-7mol/L）可減輕PO（4.05×10-6mol

8、/L）對EDR的抑制作用，且GST濃度為1×10-8～3×10-8mol/L時(shí)，該作用具有劑量效應(yīng)，但GST對SNP誘導(dǎo)的非內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)沒有影響；同時(shí)各濃度GST與PO共同孵育血管環(huán)，可濃度依賴性地抑制PE誘導(dǎo)的血管收縮；(2)RT-PCR檢測各處理組p22phox和Nox4 mRNA的表達(dá)：較之溶媒對照組（0.1%的DMSO處理），PO處理組p22phox和Nox4 mRNA表達(dá)明顯增加；GST處理組p22phox和Nox4 m

9、RNA表達(dá)明顯減少；PO+GST共同處理組，p22phox mRNA表達(dá)較之溶媒對照組有所增加，但無顯著差異（P＞0.05）；Nox4 mRNA表達(dá)增加，與溶媒對照組比較有顯著差異（P＜0.05）；與PO單獨(dú)處理組比較，PO+GST共同處理組，p22phox mRNA表達(dá)明顯減少（P＜0.05）；Nox4 mRNA表達(dá)減少，但無顯著差異；(3) western-blotting觀察p22phox和Nox4蛋白表達(dá)的變化：與溶媒對照組比較

10、，PO處理組p22phox和Nox4蛋白表達(dá)明顯增加；GST處理組p22phox和Nox4蛋白表達(dá)明顯減少；PO+GST共同處理組，p22phox蛋白表達(dá)較之溶媒對照組有所增加，但無顯著差異（P＞0.05）；Nox4蛋白表達(dá)增加，較溶媒對照組有顯著差異（P＜0.01）；與PO單獨(dú)處理組比較，PO+GST共同處理組，p22phox蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.05）；Nox4蛋白表達(dá)減少，但無顯著差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：