高尿酸和血管緊張素Ⅱ?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞的協(xié)同損傷作用.pdf

1、背景和目的：隨著我國社會的進(jìn)步，飲食條件的改善，生活習(xí)慣的改變，肥胖、糖尿病、高血壓、高血脂、高尿酸血癥等代謝性疾病的發(fā)病率逐年升高。肥胖、胰島素抵抗、高血壓、高甘油三酯血癥可以定義為代謝綜合征。解釋代謝綜合征的學(xué)說有很多，其中氧化應(yīng)激是最重要的機(jī)制之一。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，代謝綜合征(metabolism syndrome，MS)患者多伴隨有尿酸水平的升高。尿酸作為一種強(qiáng)抗氧化劑，為何反而導(dǎo)致了內(nèi)皮損傷?我們前期研究發(fā)現(xiàn)，正常尿酸水平有

2、明確的抗氧化功能，但是高尿酸(high uric acid，HUA)條件下卻可以導(dǎo)致內(nèi)皮功能損傷。我們推測血尿酸水平的升高可能屬于對于增強(qiáng)的氧化應(yīng)激的保護(hù)性代償反應(yīng)，但是過度升高會導(dǎo)致內(nèi)皮功能損傷。許多研究表明，代謝綜合征患者腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)被激活。RAS系統(tǒng)的核心成分血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)，正是通過氧化應(yīng)激和氧化還原依賴信號途徑的激活，導(dǎo)致了內(nèi)

3、皮功能的損傷。因此，本研究選取了具有代表性的AngⅡ作為內(nèi)皮損傷的主要刺激物，利用自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertension rat，SHR)構(gòu)建代謝綜合征模型，通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)闡明高尿酸(HUA)和AngⅡ?qū)?nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)系及機(jī)制。
　　方法：(1)體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系，分別用AngⅡ(1×10-7mol/L)、HUA(600μmol/L)及AngⅡ(1×10-7mol/L)+HUA(600μmo

4、l/L)刺激細(xì)胞24h建立體外模型，收集細(xì)胞上清液硝酸還原法檢測一氧化氮(nitric oxide，NO)水平變化，Western blot檢測內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)蛋白水平表達(dá)變化。共聚焦檢測各組氧化應(yīng)激產(chǎn)物活性氧(reactiveoxidative species，ROS)及其成分過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)、超氧陰離子(supe

5、roxide anion，O2·-)、單線態(tài)氧(singlet oxygen，1O2)、羥自由基(hydroxylradical，·OH)和過氧亞硝基(peroxynitrite，ONOO-)水平變化。
　　(2)以30只10周齡雄性SHR大鼠為研究對象，Wistar-Kyoto(WKY)大鼠作為空白對照，給予高脂飲食8w后，SHR大鼠隨機(jī)分為5組：MS組；HUA組；HUA+Catalase組；HUA+PEG-SOD組；HUA+E

6、palrestat組。Catalase為H2O2清除劑，PEG-SOD為O2·-清除劑，Epakestat為醛糖還原酶抑制劑。除MS組外，其余四組均腹腔注射氧嗪酸鉀和尿酸10天，建立代謝綜合征合并高尿酸血癥模型。同時，應(yīng)用不同藥物進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后均稱體重、尾動脈測血壓，內(nèi)眥取血檢測血脂(TC、TG、LDL-C、HDL-C)、腎功能(Bun、Scr)、血糖(blood glucose，BG)、尿酸(uric acid，UA)。

7、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后硝酸還原法和酶聯(lián)免疫吸附法分別檢測血清NO、H2O2、總抗氧化能力(total antioxidativecapacity，TAC)、血管性假性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)水平變化。
　　結(jié)果：(1)在體外用AngⅡ和/或HUA刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，同對照組相比，AngⅡ組、HUA組和HUA+AngⅡ組細(xì)胞上清NO水平、eNOS蛋白表達(dá)水平均下降(P<0.05)；同AngⅡ或HUA相比

8、，HUA+AngⅡ組水平明顯下降(P<0.05)。表明AngⅡ和HUA均會導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，且兩者之間有協(xié)同作用。共聚焦檢測活性氧及其成分：同對照組相比，HUA、AngⅡ、HUA+AngⅡ組細(xì)胞內(nèi)總ROS、H2O2、O2·-、·OH、ONOO-水平均升高(P<0.05)，但HUA+AngⅡ組與AngⅡ組或HUA組比較，細(xì)胞內(nèi)總ROS無明顯增強(qiáng)(P>0.05)，H2O2水平明顯升高(P<0.05)，·OH水平也明顯升高(P<0.01)。H

9、UA+AngⅡ組與HUA組比較O2·-水平升高(P<0.05)，但與AngⅡ組比較，O2-無明顯增強(qiáng)。同對照組相比，HUA組1O2水平下降(P<0.05)，AngⅡ組1O2水平升高(P<0.05)。同AngⅡ組比較，HUA+AngⅡ組1O2水平下降(P<0.05)。提示高濃度UA和AngⅡ可以增加細(xì)胞內(nèi)總ROS、H2O2、O2·-、·OH和ONOO-的生成，促進(jìn)氧化應(yīng)激發(fā)生發(fā)展。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HUA和AngⅡ?qū)?nèi)皮細(xì)胞具有協(xié)同損傷作用，

10、且同NO釋放減少和氧化應(yīng)激密切相關(guān)。
　　(2)SHR大鼠高脂飲食8w后，同基礎(chǔ)值相比，體重增加，血清TG、LDL-C空腹血糖水平明顯升高(P<0.05)，TC、HDL-C水平稍有升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。血壓無較大波動，處于高血壓狀態(tài)。腹腔注射氧嗪酸鉀和尿酸10d后，同單純高脂飲食組相比，血清尿酸水平升高。血清NO，TAC水平下降(P<0.05)、H2O2、vWF水平升高(P<0.05)。同時，我們應(yīng)用過氧化氫酶(c

11、atalase，CAT)雕化H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O和O2、聚乙烯醇超氧化物歧化酶(polyethylene glycolsuperoxide dismutase，PEG-SOD)清除超氧陰離子(O2·-)、醛糖還原酶(aldosereductase，AR)抑制劑依帕司他(epalrestat)分別對動物模型進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明：同模型組比較，各干預(yù)組血清NO、TAC水平升高，H2O2、vWF水平下降，進(jìn)一步驗(yàn)證高尿酸和AngⅡ?qū)?nèi)皮細(xì)胞的協(xié)