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文檔簡介
1、目的:以目前國際公認(rèn)的預(yù)測藥物腸道吸收的Caco-2細(xì)胞為模型,研究間硝苯地平及其同系物在Caco-2細(xì)胞上的攝取動力學(xué),對該同系物進(jìn)行腸道吸收篩選,確定出候選藥物,為該類藥物的研發(fā)提供可靠的依據(jù)。 方法:1.采用改進(jìn)的方法合成間硝苯地平及其同系物。在間硝苯地平的合成中采用一步法進(jìn)行合成,應(yīng)用濃氨水作為反應(yīng)中的氨源,進(jìn)一步優(yōu)化合成路線。在MN9202合成中,首先將合成的間硝苯地平在堿性條件下水解而生成中間體,然后利用中間體進(jìn)行酯
2、化反應(yīng),從而生成MN9202。合成的化合物運(yùn)用HPLC方法進(jìn)行檢測,確定為目標(biāo)化合物并且達(dá)到純度要求。2.采用HPLC方法建立生物樣本中間硝苯地平及其同系物在的檢測方法。3.培養(yǎng)成熟的Caco-2細(xì)胞分別與100μM的間硝苯地平、MN9201、MN9202、MN9203孵育5、10、20、30、40、60min,采用HPLC檢測細(xì)胞內(nèi)藥物濃度,觀察細(xì)胞對藥物的攝取與時間之間的關(guān)系。4.培養(yǎng)成熟的Caco-2細(xì)胞分別與50、100、200
3、、500、1000μM間硝苯地平、MN9201、MN9202、MN9203孵育一定的時間,采用HPLC檢測細(xì)胞內(nèi)藥物濃度,觀察細(xì)胞對藥物的攝取與藥物濃度之間的關(guān)系。5.用不同濃度的P-糖蛋白抑制劑(維拉帕米的濃度為10、25、100μM,環(huán)孢菌素A的濃度為5、20、50μM)與Caco-2細(xì)胞孵育30min,除去抑制劑,加入100μM間硝苯地平、MN9201、MN9202、MN9203孵育一定時間,采用HPLC檢測細(xì)胞內(nèi)藥物濃度,觀察P
4、-糖蛋白抑制劑對藥物攝取量的影響。 結(jié)果:1.合成的m-Nif、MN9202在選定的流動相條件下與對照品具有相同的出峰時間且峰形良好,純度大于95%,合成的化合物在237nm和350nm處均具有特征吸收峰。2.由于間硝苯地平及其同系物在237nm處的紫外吸收峰較350nm處強(qiáng)2-3倍,加之細(xì)胞樣品內(nèi)源性干擾少,因此選擇237nm作為檢測波長;利用堿化液處理樣品,選用乙醚對生物樣品中的藥物進(jìn)行提取,降低了內(nèi)源性物質(zhì)的干擾,提高了藥
5、物的提取率以及檢測的特異性和靈敏度。檢測m-Nif和MN9201的流動相組成為:乙腈/水=75/25,流速為1mL/min,檢測波長237nm;檢測MN9202和MN9203的流動相組成為:乙腈/水=82/18,流速為1mL/min,檢測波長237nm。檢測m-Nif的工作曲線回歸方程為Y=0.1319+0.0048X(r=0.9998,n=7),線性范圍為20-1000ng/mL,其低、中、高三個濃度的日間RSD分別為8.52%、6.
6、70%、8.61%,日內(nèi)RSD為1.55%、2.37%、2.98%(n=7)。檢測MN9201的工作曲線回歸方程為Y=-0.0085+0.0044X(r=0.9998,n=7),線性范圍為20-1000ng/mL,其低、中、高三個濃度的日間RSD分別為6.52%、9.70%、8.61%,日內(nèi)RSD為3.63%、7.45%、10.01%(n=7)。檢測MN9202的工作曲線回歸方程為Y=0.0592+0.0048X(r=0.9999,n=
7、7),線性范圍為20-1000ng/mL,其低、中、高三個濃度的日間RSD分別為10.97%、13.25%、14.23%,日內(nèi)RSD分別為5.09%、7.62%、7.22%(n=7)。檢測MN9203的工作曲線回歸方程為Y=0.1654+0.0048X(r=0.9996,n=7),線性范圍為40-1000ng/mL,其低、中、高三個濃度的日間RSD分別為14.65%、7.88%、9.89%(n=7),日內(nèi)RSD為9.55%、5.78%、
8、6.01%(n=7)。3.Caco-2細(xì)胞對間硝苯地平、MN9202、MN9201的攝取,在孵育時間分別為20、30、40分鐘時達(dá)到最大,攝取藥物的最大量分別為4250±9、25855±517、47013±623pmoL/mg蛋白;而細(xì)胞對MN9203的攝取量在孵育60min后仍有上升的趨勢。4Caco-2細(xì)胞對間硝苯地平、MN9201、MN9202的攝取在藥物濃度為500uM時達(dá)到最大,而細(xì)胞對MN9203的攝取隨著濃度的增加呈增加的
9、趨勢,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)未見最大值出現(xiàn)。間硝苯地平的最大攝取量為5772±395pmoL/mg蛋白,MN9201達(dá)到的最大攝取量為1539×103±13133pmoL/mg蛋白,MN9202達(dá)到的最大攝取量為7615±83pmoL/mg蛋白。5.不同濃度P-糖蛋白抑制劑對該類藥物攝取的影響各不相同。P-糖蛋白抑制劑對間硝苯地平的攝取沒有明顯的影響。應(yīng)用低、中、高濃度維拉帕米后,細(xì)胞對MN9201和MN9202的攝取量沒有顯著的增加(p>0
10、.05);低濃度的維拉帕米對MN9203的攝取量沒有顯著影響(p>0.05),但中濃度和高濃度的維拉帕米可使細(xì)胞對MN9203的攝取顯著增加(p<0.05)。用低、中、高三個濃度的環(huán)孢菌素A處理之后,細(xì)胞對MN9201的攝取量明顯增加(p<0.05);中濃度和高濃度的環(huán)孢菌素A可使細(xì)胞對MN9202的攝取量顯著增加(p<0.05);低濃度的環(huán)孢菌素A處理后,細(xì)胞對MN9203的攝取呈現(xiàn)明顯上升的趨勢,而中濃度和高濃度組對MN9203的攝
11、取卻沒有明顯影響(p>0.05)。應(yīng)用P-糖蛋白抑制劑之后,除間硝苯地平外,細(xì)胞對MN9201、MN9202、MN9203的攝取量有不同程度的增加。 結(jié)論:1.改良之后的合成路線能夠合成出具有較高純度的間硝苯地平及MN9202同系物,且縮短了反應(yīng)時間。2.本文建立的生物樣品中二氫吡啶類藥物的HPLC檢測方法,具有準(zhǔn)確、靈敏、可靠、簡便的特點(diǎn)。3.Caco-2細(xì)胞對間硝苯地平同系物的攝取存在時間依賴、濃度依賴關(guān)系。四種藥物中,細(xì)胞
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