高檸檬酸同系物的合成及固氮酶催化反應(yīng)中的質(zhì)子傳遞研究.pdf

1、固氮酶催化作用的分子機(jī)理40多年來(lái)一直是多學(xué)科研究的熱點(diǎn)。自上世紀(jì)90年代初固氮酶鉬鐵蛋白和鐵蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)成功解析以來(lái)，國(guó)際上有關(guān)固氮酶結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系研究十分活躍并取得了很大的進(jìn)展，但還有一些與酶促反應(yīng)動(dòng)態(tài)有關(guān)的關(guān)鍵問(wèn)題，如N2與活性中心作用的位置和配位活化與反應(yīng)機(jī)理、質(zhì)子(電子)傳遞途徑、固氮酶酶促還原N2為什么必須放氫等，至今尚未見(jiàn)明確答案。
　　 本文通過(guò)閱讀大量的文獻(xiàn)資料，對(duì)固氮酶研究的最新進(jìn)展進(jìn)行了綜合評(píng)述

2、，并對(duì)一些重要的問(wèn)題提出自己的看法和見(jiàn)解。在論文工作方面，作者主要在本課題組長(zhǎng)期工作積累的基礎(chǔ)上，進(jìn)行固氮酶催化作用機(jī)理相關(guān)的課題研究，其主要工作可概括為以下幾個(gè)方面：
　　 (1)設(shè)計(jì)了一條合成高檸檬酸及其同系物的路線。
　　 高檸檬酸是固氮酶發(fā)揮正常功能所不可或缺的有機(jī)組份。盡管通常認(rèn)為高檸檬酸是質(zhì)子(電子)傳遞的載體，但有關(guān)它在酶促反應(yīng)中承擔(dān)的具體功能還不清楚。根據(jù)Ludden等提出的參與FeMoco生物離體合成的

3、有機(jī)羧酸的結(jié)構(gòu)模型并結(jié)合我們實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期以來(lái)在固氮酶基礎(chǔ)研究方面的工作積累，我們推斷高檸檬酸的同系物對(duì)酶促固氮活性的影響可能與高檸檬酸相近。通過(guò)這些同系物對(duì)酶促反應(yīng)活性影響的研究，將有可能揭示高檸檬酸的重要作用。
　　 由于商業(yè)渠道獲得的高檸檬酸價(jià)格非常昂貴(＞1000美元/克)，而且其同系物至今仍未見(jiàn)報(bào)道，因此在本論文中，我們首先設(shè)計(jì)了一條合成高檸檬酸及其同系物的路線(Scheme1和Scheme2)。
　　 Schem

4、e1
　　 Scheme2
　　 在所設(shè)計(jì)的路線中，反應(yīng)的關(guān)鍵步驟是底物α-氧代二羧酸(酯)的制備，底物α-氧代二羧酸(酯)在金屬銦介入下的烯丙基烷基化，以及隨后烯丙基雙鍵的氧化。與其它合成方法相比，本路線不僅靈活多用、適于較大量制備，而且關(guān)鍵步驟分別使用水和乙酸乙酯做溶劑，比較符合現(xiàn)代綠色化學(xué)發(fā)展的要求。
　　 更為重要的是，高檸檬酸及其同系物的合成，為我們研究高檸檬酸的功能、以及化學(xué)模擬FeMoco鉬原子的配

5、位微環(huán)境提供了非常重要的探針手段。
　　 (2)探討配體取代方法代替FeMoco生物離體合成的可行性。
　　 FeMoco的生物離體合成需要UW45(缺FeMoco的鉬鐵蛋白)、基因nifE、nifN等的參與，其過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜繁瑣。從配位化學(xué)的觀點(diǎn)看，高檸檬酸被其它有機(jī)羧酸替換屬于典型的配體取代反應(yīng)。因此在本文中，我們反復(fù)嘗試配體取代的方法調(diào)變鉬鐵蛋白鉬位上的外配體，以探討其代替FeMoco生物離體合成的可行性。
　

6、　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種配體取代的方法局限性很大。因此為了研究所合成的探針?lè)肿訉?duì)酶促固氮活性的影響、進(jìn)一步揭示高檸檬酸在酶促反應(yīng)中承擔(dān)的重要功能，看來(lái)仍須采用生物離體合成的方法。但由于條件限制，這項(xiàng)工作只能稍后進(jìn)行。
　　 (3)研究了不同N2濃度對(duì)C2D2還原活性和加氫還原產(chǎn)物C2D2H2立體選擇性的影響。
　　 C2D2是一個(gè)非常重要的分子探針。在本文中，我們對(duì)本研究組1995年提出的一種分子探針實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了復(fù)試，

7、研究了不同N2濃度對(duì)C2D2還原活性和加氫還原產(chǎn)物C2D2H2立體選擇性的影響。取得了新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，加深了我們對(duì)固氮酶催化作用本質(zhì)的理解。
　　 (4)提出固氮酶質(zhì)子傳遞的可能途徑。
　　 質(zhì)子是所有底物還原所必須的。但在固氮酶中，質(zhì)子的來(lái)源及其傳遞的方式/途徑目前仍存在不小的爭(zhēng)議。質(zhì)子傳遞是固氮酶催化機(jī)制的重要組成部分，對(duì)其深入研究將有助于理解固氮酶催化作用的分子機(jī)理。
　　 在本論文中，我們通過(guò)分析高分辨的固

8、氮酶鉬鐵蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)并結(jié)合已知的酶促反應(yīng)及其它生化結(jié)果，提出了固氮酶質(zhì)子傳遞的可能途徑，從而進(jìn)一步充實(shí)了本課題組早期提出的固氮酶中存在兩條質(zhì)子傳遞通道的論據(jù)。
　　 總之，本論文的研究工作具有較為重要的創(chuàng)新性和學(xué)術(shù)價(jià)值。高檸檬酸及其同系物的合成，為我們研究高檸檬酸的功能以及揭示固氮酶催化作用的分子機(jī)理提供了非常重要的分子探針；N2對(duì)C2D2還原的抑制行為研究，以及質(zhì)子傳遞途徑的研究，進(jìn)一步深化我們對(duì)固氮酶的認(rèn)識(shí)，加深我們固