合成魚腥草素同系物對巨噬細胞免疫調(diào)節(jié)功能的初步研究.pdf

1、魚腥草是三白草科(Saururaceae)中一種重要的藥用植物,具有抗菌、消炎作用。魚腥草素(癸酰乙醛)是其主要的抗菌有效成分。由于天然魚腥草素在魚腥草中含量很小,且難溶于水、化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定,所以通常用亞硫酸氫鈉修飾其醛基,得到活性不變、性質(zhì)更穩(wěn)定的合成魚腥草素,并在臨床上得到了廣泛使用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,合成魚腥草素不僅具有抗菌、消炎的功效,還具有免疫調(diào)節(jié)功能。很多體內(nèi)動物試驗和臨床使用報道顯示,合成魚腥草素能提高機體特異性和非特異

2、性免疫功能。體外試驗顯示,合成魚腥草素能夠促進T淋巴細胞培養(yǎng)液中IL-2水平的提高；能夠激活巨噬細胞,提高其吞噬能力,促進其產(chǎn)生酸性磷酸酶、溶菌酶等水解酶類,增強其呼吸爆發(fā),提高細胞內(nèi)游離鈣離子的濃度。
　　 本文的目的是研究合成魚腥草素同系物(HOU-C8:辛酰乙醛磺酸鈉；HOU-C10:癸酰乙醛磺酸鈉；HOU-C12:十二酰乙醛磺酸鈉；HOU-C14:十四酰乙醛磺酸鈉；HOU-C16:十六酰乙醛磺酸鈉)對巨噬細胞免疫功能的影

3、響,探究在體外試驗中合成魚腥草素同系物調(diào)節(jié)巨噬細胞免疫功能的作用與濃度和碳鏈長度之間的關(guān)系。
　　 首先檢測了合成魚腥草素同系物(HOU-Cn,n=8,10,12,14,16)對巨噬細胞分泌的溶菌酶活性的影響。巨噬細胞與合成魚腥草素同系物(終濃度分別為0μg/mL、0.50μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL)共培養(yǎng)24小時后,檢測培養(yǎng)

4、液中溶菌酶的比活力。然后,為了明確培養(yǎng)液中的合成魚腥草素是否影響溶菌酶的活性,專門設(shè)計實驗檢測合成魚腥草素同系物與溶菌酶結(jié)合后,溶菌酶活性的變化:并且還通過溶菌酶中Tyr殘基和Typ殘基熒光光譜的變化,來確定溶菌酶分子的空間構(gòu)象是否因為合成魚腥草素同系物的結(jié)合而發(fā)生了變化。
　　 酸性磷酸酶在巨噬細胞的溶酶體中發(fā)揮作用,降解通過吞噬作用進入細胞的抗原。巨噬細胞溶酶體中的酸性磷酸酶是耐酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)。巨噬細胞與合成

5、魚腥草素同系物(終濃度分別為0μg/mL、0.50μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL)共培養(yǎng)24小時后,用新鮮的10％NBS RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌3次,然后加入該培養(yǎng)液,反復(fù)凍融3次裂解細胞,檢測細胞裂解后上清液中TRAP的比活力。
　　 巨噬細胞的呼吸爆發(fā)過程產(chǎn)生反應(yīng)性氧中間物(ROI),ROI可以在細胞內(nèi)發(fā)揮作用,也可以分

6、泌到細胞外。它們參與抗原的降解,具有殺菌、殺傷腫瘤細胞的作用。用DCFH-DA檢測經(jīng)不同濃度合成魚腥草素同系物處理后巨噬細胞的呼吸爆發(fā)強度,在525nm處的熒光強度的變化可以間接顯示呼吸爆發(fā)強度的變化。
　　 鈣離子在細胞內(nèi)多條細胞信號通路中起作用,在細胞生理過程的調(diào)控中起重要作用。不同濃度的合成魚腥草素同系物與巨噬細胞分別在無新霉素和含1.5mmol/L新霉素的條件下相互作用,用Fura-2檢測胞內(nèi)游離鈣離子的強度,從而確定H

7、OU-Cn(n=8,10,12,14,16)在不同濃度下對胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響,以及新霉素對磷脂酶C(PLC)的抑制是否影響到胞內(nèi)鈣離子的釋放。
　　 合成魚腥草素同系物(HOU-Cn,n=8,10,12,14,16)一般在0～2.0μg/mL濃度之間均有提高巨噬細胞培養(yǎng)液中溶菌酶比活力的作用,同時在低于2.0μg/mL的濃度下,巨噬細胞培養(yǎng)液中溶菌酶水平具有隨著同系物碳鏈的延長而上升的趨勢。HOU-Cn(n=8,10,12

8、,14,16)對溶菌酶活性有抑制作用,通過與蛋白分子的疏水結(jié)合,引起酶分子空間構(gòu)象的改變,導(dǎo)致酶活性的喪失；這種抑制作用隨著HOU-Cn(n=8,10,12,14,16)濃度的增大或碳鏈的延長,而逐步提高。
　　 HOU-Cn(n=8,10,12,14,16)在低濃度下促進巨噬細胞產(chǎn)生TRAP,在0～2.0μg/mL濃度內(nèi),TRAP比活力有隨著濃度上升而提高的趨勢。在較高濃度(16～64μg/mL)下,巨噬細胞產(chǎn)生的TRAP活性

9、隨著HOU-Cn(n=8,10,12,14,16)碳鏈的延長有上升的趨勢。
　　 合成魚腥草素同系物(HOU-Cn,n=8,10,12,14,16)在無外來抗原性異物(如ConA)的條件下,均能提高巨噬細胞呼吸爆發(fā)的強度,促進反應(yīng)性氧中間物的產(chǎn)生。HOU-Cn(n.8,10,12,16)在0～16μg/mL濃度間對巨噬細胞呼吸爆發(fā)的都具有顯著的促進作用,并且都有劑量依賴性。HOU-C14在0.50～64μg/mL濃度間能夠使巨噬

10、細胞的呼吸爆發(fā)強度顯著高于對照組(HOU-C14的濃度是0μg/mL),但濃度的變化對呼吸爆發(fā)的影響不顯著。
　　 HOU-Cn(n=8,10,12,14,16)通過活化PLC,促進IP3的產(chǎn)生,開啟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣離子通道,提高巨噬細胞胞內(nèi)游離鈣離子的濃度,IP3似乎是巨噬細胞胞內(nèi)鈣庫釋放鈣離子的唯一途徑。鈣離子是呼吸爆發(fā)作用所必需的,細胞內(nèi)鈣離子濃度的上升引發(fā)了巨噬細胞呼吸爆發(fā)的增強；鈣離子是多種細胞信號通路中重要的信號,可以啟

11、動一些免疫相關(guān)基因的表達。HOU-Cn(n=8,10,12,14)在0～16μg/mL的濃度范圍內(nèi),隨著濃度的上升或者碳鏈的延長,促進胞內(nèi)鈣離子釋放的作用越強。HOU-C16促進胞內(nèi)鈣離子釋放的作用隨濃度的上升呈下降趨勢,在16～64μg/mL的濃度范圍內(nèi)不具有促進胞內(nèi)鈣離子釋放的作用。
　　 經(jīng)過初步試驗研究,合成魚腥草素同系物HOU-Cn(n=8,10,12,14,16)能夠提高巨噬細胞產(chǎn)生的溶菌酶和酸性磷酸酶的活性,促進降