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文檔簡介
1、本研究包括兩部分:
第一部分:突變型pAAV-CD151真核表達載體的構建與鑒定
目的:構建pAAV-CD151-AAA 194-196 突變體,為研究CD151的功能及CD151-整合素a3/a6 復合體的功能奠定基礎。
方法:以pAAV-CD151-HA 質粒為模板,采用定點突變技術,通過重疊PRC 方法構建整合素a3/a6 結合缺陷的AAA 突變體(pAAV-CD151-AAA 194-1
2、96 突變體),并用三質粒鈣磷共轉染的方法包裝成重組腺相關病毒rAAV-CD151-AAA 194-196,斑點雜交法檢測病毒滴度,病毒滴度均達到1011以上。
結果:經過測序鑒定成功構建了pAAV-CD151-AAA 194-196 突變體,斑點雜交法病毒滴度檢測證實成功包裝了重組腺相關病毒。
結論:成功構建pAAV-CD151-AAA 194-196 突變體并包裝成重組腺相關病毒,為進一步研究CD151的
3、功能和作用機制奠定了基礎。
第二部分:CD151基因促進前列腺癌細胞增殖、遷移及其機制
目的:有研究表明CD151在前列腺癌組織中的高表達與前列腺癌的轉移和預后密切相關,但其具體機制尚不清楚。本實驗首先構建CD151-整合素結合缺陷突變體,然后分別將CD151基因及整合素結合缺陷的CD151 突變體基因轉染人前列腺癌細胞株PC3細胞,然后觀察PC3細胞的增殖和遷移能力的變化從而探討CD151-整合素復合體及C
4、D151對前列腺癌細胞的作用及其可能的機制。
方法:用FugeneHD分別將質粒pAAV-CD151、pAAV-CD151-AAA 194-196(整合素a3/a6 結合缺陷突變體)、pAAV-GFP和等體積PBS轉染入PC3細胞,轉染入PC3細胞,72小時后,將細胞消化、傳代至六孔板、96孔板,繼續(xù)培養(yǎng)48小時后做Western blot檢測CD151 蛋白、整合素a3、整合素a6、的表達和磷酸化ERK和總ERK的表達(
5、細胞外信號調節(jié)激酶)。通過免疫共沉淀方法研究CD151 與整合素a3/a6 形成功能性復合體的能力。通過MTT方法研究CD151基因對PC3細胞增殖的影響,通過Boyden 趨化小室研究CD151基因對PC3細胞遷移的影響。
結果:CD151組和CD151-AAA 194-196 突變體組的CD151 蛋白表達水平較對照組和GFP組明顯增加;CD151組的CD151-整合素a3/a6表達水平明顯高于對照組和GFP組;CD1
6、51 突變體組的CD151-整合素a3/a6 復合體表達水平明顯低于對照組和GFP組。此外,CD151組的PI3K、磷酸化Akt、磷酸化ERK的表達量明顯高于其它三組(P<0.05),CD151 突變體組的PI3K、磷酸化Akt、磷酸化ERK的表達量最低,明顯低于對照組和GFP組(P<0.05);CD151組的細胞增殖能力比對照組和GFP組明顯增高(相對吸光值分別為:0.675±0.083vs0.383±0.062和0.413±0.07
7、2),ERK 抑制劑組和PI3K 抑制劑組的細胞增值能力與CD151組相比明顯減弱;CD151組的細胞遷移數(shù)(107.8±9.6)亦顯著高于對照組和GFP組(53.0±7.6和57.0±5.2,P<0.05);CD151 突變體組的細胞增殖和遷移能力最低。
結論:CD15I在前列腺癌細胞的發(fā)展、轉移中起重要的作用,是腫瘤轉移的重要分子基礎。其分子機制為CD151 與整合素a3/a6 形成復合體促進ERK信號通路、PI3K/
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