siRNA靶向沉默OCT4基因?qū)η傲邢侔〥U145細(xì)胞和PC3細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響.pdf

1、目的：使用siRNA靶向沉默人前列腺癌DU145細(xì)胞和PC3細(xì)胞OCT4基因的表達(dá)，觀察OCT4基因的沉默對DU145細(xì)胞和PC3細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲力等生物學(xué)行為的影響，為進(jìn)一步從分子水平阻斷前列腺癌發(fā)展提供靶基因。
　　方法：(1)設(shè)計(jì)并體外化學(xué)合成3對針對人OCT4基因的特異性siRNA和1對綠色熒光素標(biāo)記的FAM-siRNA作為陰性對照序列。(2)通過使用脂質(zhì)體(LipofectaminTM2000)將FAM-siRNA

2、分別轉(zhuǎn)染入人前列腺癌DU145細(xì)胞和PC3細(xì)胞;通過熒光顯微鏡檢測表達(dá)綠色熒光素的兩種細(xì)胞，評估siRNA轉(zhuǎn)染效率。(3)利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將各3對siRNA分別轉(zhuǎn)染入DU145細(xì)胞和PC3細(xì)胞，設(shè)置空白對照組和陰性對照組，收集轉(zhuǎn)染48h后的兩種細(xì)胞，分別提取總RNA和總蛋白，使用RT-PCR和Western blot技術(shù)分別檢測OCT4 mRNA及蛋白表達(dá)水平，篩選有效靶點(diǎn)。(4)將篩選出的最佳干擾序列siRNA-1分別轉(zhuǎn)染入DU145

3、細(xì)胞和PC3細(xì)胞，采用CCK-8法檢測siRNA對DU145細(xì)胞和PC3細(xì)胞增殖的影響，Annexin V-PI法檢測細(xì)胞凋亡情況，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力的變化。
　　結(jié)果：(1)熒光顯微鏡觀察檢測顯示，F(xiàn)AM-siRNA轉(zhuǎn)染效率DU145細(xì)胞約92％，PC3細(xì)胞約94％。(2) RT-PCR結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞的電泳結(jié)果均見實(shí)驗(yàn)組OCT4 mRNA的表達(dá)低于陰性對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

4、，其中均以siRNA-1轉(zhuǎn)染組下調(diào)最明顯，選為最佳特異性siRNA。Western blot結(jié)果顯示兩種細(xì)胞的siRNA-1實(shí)驗(yàn)組OCT4蛋白的表達(dá)水平均低于陰性對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(3) CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h三組細(xì)胞增殖水平，根據(jù)測定的OD值評估各組細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)24h、48h、72h時(shí)，siRNA-1組OD值與空白組和NC組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，計(jì)

5、算siRNA-1組轉(zhuǎn)染24h，48h和72h抑制率，我們發(fā)現(xiàn)72h抑制率最高，DU145細(xì)胞為(33.8±3.2)％，PC3細(xì)胞為(38.4±5.1)％。(4)流式細(xì)胞儀技術(shù)測轉(zhuǎn)染后48h細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示:DU145細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-1組凋亡率為(47.61±2.92)％，PC3細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-1組凋亡率為(27.36±4.19)％，與各自的空白組和NC組相比較，凋亡率均增高(P＜0.05)，而空白組和NC組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)

6、計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(5) Transwell法測轉(zhuǎn)染后24h三組細(xì)胞侵襲力，結(jié)果顯示:siRNA-1組穿過Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)明顯少于空白組和NC組(P＜0.05)，而空白組和NC組之間無明顯差別(P＞0.05)。
　　結(jié)論： siRNA有效地阻斷了前列腺癌DU145細(xì)胞和PC3細(xì)胞中OCT4基因的表達(dá)，OCT4基因在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05），并抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時(shí)降低腫瘤