小鼠孤雌胚胎與雄性胚胎嵌合培養(yǎng)方法與效果研究.pdf

1、本研究對小鼠早期胚胎進行性別鑒定，獲得雄性胚胎后與孤雌激活胚胎進行聚合培養(yǎng)，其目的是為了建立一種新的異性胚胎嵌合培養(yǎng)模式，在便于通過分子生物學方法對不同來源胚胎發(fā)育效果進行性別檢測的基礎(chǔ)上，研究兩種不同類型胚胎細胞之間在嵌合發(fā)育過程中的相互影響，為從嵌合發(fā)育胚胎中分析標記來源于孤雌胚胎的干細胞研究過程奠定基礎(chǔ)。本研究初步建立了構(gòu)建孤雌激活胚胎與雄性胚胎嵌合胚的方法與程序，對該過程中的幾個影響因素做了初步的探討。主要研究結(jié)果如下：

2、 1.雙重PCR法鑒定小鼠早期胚胎性別研究 對引物設計的合理性以及雙重PCR對早期胚胎性別鑒定的效果進行探討，以期解決單對Sty基因引物擴增時易出現(xiàn)假陰性的問題，優(yōu)化PCR反應體系。 (1)引物設計及其合理性檢測：自主設計公鼠所特有的Sry基因引物SRY250U/SRY250L和公母小鼠所共有的Zfx基因引物ZFX399U/ZFX399用于小鼠性別鑒定。應用所設計的兩對引物分別對公母小鼠肝臟組織基因組進行體外擴增。結(jié)果顯

3、示，兩對引物均能有效的對上述基因進行擴增，產(chǎn)生特異的DNA片段，與理論設計相符。 (2)雙重PCR鑒定小鼠肝臟組織細胞性別研究為了杜絕單一Sry基因擴增失敗或胚胎丟失導致的假陰性現(xiàn)象，本試驗應用上述雙重PCR分別對已知性別的4只公鼠和4只母鼠肝臟組織基因組進行性別鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)公鼠有339bp的Zfx基因序列片段和250bp的Sry基因序列片段，而母鼠則只有339bp的Zfx基因序列片段，證明運用經(jīng)優(yōu)化的雙重PCR體系能夠有效擴

4、增出所需基因序列，能夠用于小鼠性別的判定。 (3)小鼠早期胚胎性別鑒定最適胚胎模板量研究應用前面試驗優(yōu)化的性別鑒定體系分別以4個和2個胚胎卵裂球為模板對小鼠8-細胞胚胎進行了性別鑒定。結(jié)果顯示，以4個卵裂球為模板的雄性和雌性胚胎比率(17/19，0.89)更接近1.所以在早期胚胎性別鑒定中取4個卵裂球為模板更能保證鑒定的準確性。 2.不同化學方法對小鼠卵母細胞激活效果研究 (1)單個激活劑(乙醇、SrCl2)不同

5、處理時間對小鼠母細胞孤雌激活效果的影響本試驗旨在探討乙醇和SrCl2不同處理時間對小鼠母細胞孤雌激活效果的影響。試驗結(jié)果表明，10mmol/L SrCl2處理卵母細胞6h比單獨使用7％乙醇處理會獲得更好的激活效果，其的激活率、2～8細胞胚胎率、囊胚率分別為72.38％、69.52％、29.52％。 (2)乙醇、Srcl：與6-DMAP聯(lián)合激活不同處理時間對小鼠卵母細胞激活效果的影響本試驗旨在探討乙醇、SrCl2分別與6-DMAP

6、聯(lián)合，不同處理時間對小鼠卵母細胞激活效果的影響。試驗結(jié)果表明，用7％的乙醇對卵母細胞處理5min后再用2.5 mmol/L 6-DMAP作用4h的方式激活得到的激活率(89.58％)和囊胚率(38.54％)最高，另外用10mmol/L SrCl2處理卵母細胞4h后再用2.5 mmol/L 6-DMAP作用4h的方式也可以獲得激活率84.85％、2～8細胞率65.66％的激活效果。 3.小鼠雄性胚胎與孤雌胚胎嵌合體制作及培養(yǎng)研究

7、 (1)不同去帶液對胚胎聚合效果的影響本試驗旨在考察不同濃度的鏈蛋白酶液，不同處理時間對8-細胞胚胎取帶效果以及發(fā)育情況的影響。研究結(jié)果表明，0.25％鏈蛋白酶處理10min的胚胎聚合率(86.36％)和發(fā)育率(75.73％)較高，但裸胚率(32.35％)較低；0.5％鏈蛋白酶液處理卵母細胞20min的裸胚率較高，但胚胎發(fā)育情況較差。在考慮到去帶效率和去帶效果兩個因素，選擇0.5％鏈蛋白酶液處理卵母細胞10min的最理想，可獲得3

8、8.03％的裸胚率和81.48％的胚胎聚合率。 (2)不同培養(yǎng)體系對雄性胚胎與孤雌胚胎嵌合體發(fā)育影響的研究本試驗旨在探討不同聚合培養(yǎng)體系對雄性胚胎與孤雌胚胎嵌合體發(fā)育的影響。研究結(jié)果表明，自制凹窩培養(yǎng)體系對聚合胚胎的培養(yǎng)效果比PHA微滴培養(yǎng)體系好，其聚合胚胎率、聚合胚胎發(fā)育率以及囊胚率也較高，分別為72.7％、30.3％和15.1％。 結(jié)論：雙重PCR法鑒定小鼠早期胚胎性別，以4個卵裂球為DNA擴增的模板量，鑒定8-細胞

9、胚胎性別的有效率可達到92.3％。成熟的卵母細胞使用7％的乙醇處理5min后再用2.5mmol/L 6-DMAP作用4h的激活方式能夠獲得數(shù)量與質(zhì)量都比較好的孤雌胚胎，將已知性別的雌雄兩種早期胚胎在0.5％鏈蛋白酶液中處理10min去除透明帶的效果比較好，將這種來源不同的兩性胚胎通過自制的凹窩培養(yǎng)體系直接通過相互接觸而比較容易聚合發(fā)育，其嵌合發(fā)育至囊胚的比率達到了30.3％。該結(jié)果為后期利用兩性嵌合胚胎囊胚期的內(nèi)細胞團提取干細胞，并通過