昆明白小鼠胚胎生殖細胞的分離與培養(yǎng).pdf

1、胚胎生殖細胞(Embryonic germ cells，EG cells)是繼胚胎癌細胞和胚胎干細胞之后發(fā)現(xiàn)的又一多能性干細胞。本研究以昆明白小鼠胎兒生殖嵴為材料，從原始生殖細胞中分離出EG細胞，并進行傳代培養(yǎng)和鑒定，對影響EG細胞分離與培養(yǎng)的因素進行了探討，為進一步建立昆明白小鼠EG細胞系奠定基礎(chǔ)。主要實驗結(jié)果如下： 1)試驗比較了三種分離培養(yǎng)方法對獲得小鼠原代MEF的影響，發(fā)現(xiàn)酶消化法的分離效果好于組織塊法和酶結(jié)合組織塊法，

2、適合原代MEF的分離。制作成纖維細胞飼養(yǎng)層時，10μtg/mL絲裂霉素C處理90min可以有效抑制成纖維細胞的增殖，適合用于MEF飼養(yǎng)層的制作。 2)試驗比較了采用不同胎齡胎兒分離培養(yǎng)EG細胞的效果，發(fā)現(xiàn)8.5dpc～10.5dpc胚胎初次分離所獲得的EG細胞集落較少，后期傳代能力也較差，難以有效建立EG細胞系；而11.5dpc～12.5dpc日齡胚胎初次分離獲得的類ES細胞集落較多，后期傳代能力較強，最高可傳至7代，有利于EG

3、細胞的長期培養(yǎng)。 3)試驗比較了“一次消化法”和“多次消化法”對EG細胞分離培養(yǎng)方面的影響，發(fā)現(xiàn)“多次消化法”可以得到較高的原代EG細胞克隆率，還能保持較高的細胞增殖能力，好于“一次消化法”，適宜于EG細胞的分離和傳代。 4)使用0.125％胰蛋白酶+0.02％EDTA的消化液進行多次消化，原代EG細胞克隆率和平均傳代次數(shù)較高，可取得較好的分離效果，但與0.1％的膠原酶Ⅳ組和0.25％胰蛋白酶+0.04％EDTA組相比差

4、異不顯著，5)大鼠心肌細胞條件培養(yǎng)液在小鼠EG細胞分離培養(yǎng)過程中，EG細胞克隆形成率和最高傳代數(shù)均高于EG細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液組;在EG細胞的傳代培養(yǎng)中,RH-CM組培養(yǎng)效果最好,最高傳至7代而不分化。 6)試驗比較了三種傳代方法對小鼠胚胎生殖細胞細胞分離培養(yǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)“連同飼養(yǎng)層消化法”簡單易行，而且傳代效果較好，EG細胞克隆形成率和傳代數(shù)均好于“機械離散法”，同“酶消化法”相比差異不顯著，二者最高均傳至7代。 7)試驗比