昆明白小鼠胚胎干細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells,ESCs)是一種從哺乳動(dòng)物囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cellmass,ICM)或者原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells,PGCs)中分離出來的一群具有全能性分化潛能的未分化細(xì)胞。自從小鼠胚胎干細(xì)胞系成功建立以來,胚胎干細(xì)胞憑借著其獨(dú)特的全能性以及無限增殖能力受到了眾多研究者的青睞。人們對(duì)它寄予厚望,越來越多的研究領(lǐng)域希望通過胚胎干細(xì)胞來攻克以前難以攻克的難題。<

2、br>　　 本實(shí)驗(yàn)的目的是希望通過對(duì)昆明白小鼠囊胚的培養(yǎng),從其自然孵化的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)中分離培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞,摸索昆白品系胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)條件,建立昆明白小鼠胚胎干細(xì)胞系。并且利用建立的胚胎干細(xì)胞系作為介導(dǎo),用胚胎干細(xì)胞法建立昆明種熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型。ES細(xì)胞的無血清無滋養(yǎng)層培養(yǎng)是一項(xiàng)難度較大的工作,且現(xiàn)有的ES細(xì)胞系大多是用國外品系的近交系小鼠建立的。昆明白小鼠作為我國應(yīng)用最多的遠(yuǎn)交系實(shí)驗(yàn)小鼠,其繁殖能力強(qiáng)及遺傳差異大的特點(diǎn)使

3、得其有著廣泛的應(yīng)用前景,并且其低廉的價(jià)格使得實(shí)驗(yàn)的成本大大降低,更適合于節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。建立昆明白小鼠ES細(xì)胞系以及該品系的轉(zhuǎn)基因小鼠有利于以其為實(shí)驗(yàn)材料的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的順利高效進(jìn)行,并且可以大大降低大規(guī)模實(shí)驗(yàn)的成本。而無血清無滋養(yǎng)層培養(yǎng)更是可以避免動(dòng)物源性,簡化實(shí)驗(yàn)操作步驟,提高實(shí)驗(yàn)的效率。
　　 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過對(duì)昆明白小鼠囊胚ICM的培養(yǎng),成功的獲得并培養(yǎng)了三株昆明白小鼠胚胎干細(xì)胞,并且對(duì)其進(jìn)行了多方面的鑒定,主要結(jié)論如下:
　

4、　 (1)用3i培養(yǎng)液成功培養(yǎng)囊胚,并由囊胚自然孵化獲得胚胎干細(xì)胞。
　　 (2)用2×3i培養(yǎng)液成功培養(yǎng)了獲得的昆明白小鼠胚胎干細(xì)胞,傳代數(shù)在40代以上。
　　 (3)對(duì)獲得的昆明白小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色,結(jié)果呈陽性。
　　 (4)對(duì)獲得的昆明白小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測,結(jié)果呈陽性。
　　 (5)對(duì)獲得的昆明白小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測Oct4及Sox2,結(jié)果均有表

5、達(dá)。
　　 (6)對(duì)獲得的昆明白小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行Real-Time qRT-PCR檢測Oct4、Sox2、Klf4,結(jié)果表達(dá)量與mESC接近,與MEF有顯著差別。
　　 (7)對(duì)獲得的昆明白小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行畸胎瘤成瘤實(shí)驗(yàn),6周左右成瘤,成瘤率在85％左右。
　　 (8)用pLV300-H794病毒感染獲得的昆明白小鼠胚胎干細(xì)胞,獲得帶有紅色熒光的昆明白小鼠胚胎干細(xì)胞。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用最新的3i培養(yǎng)系