microRNA-224通過降低TRIB1的表達抑制人類前列腺癌的進展.pdf

1、研究背景和目的:
　　前列腺癌(prostate cancer,PCa)是一種泌尿系統(tǒng)的嚴重疾病,在歐美國家它是男性癌癥中僅次于肺癌的第二號殺手。以美國為例,近十年來,前列腺癌發(fā)病率每年穩(wěn)定在二十萬例左右,死亡率接近20％。我國雖然是前列腺癌的低發(fā)病區(qū),但隨著人群壽命的延長、飲食結構的改變和疾病監(jiān)測意識的提高,前列腺癌的發(fā)病率逐年上升,并成為威脅我國老年男性生命的重要疾病。
　　隨著血清前列腺特異性抗原(prostate s

2、pecificantigen,PSA)在臨床診斷上的廣泛應用,前列腺癌的診斷及治療已經取得長足的進步。前列腺癌根治術是目前最常用的手段,但是25%-50%的病人發(fā)生術后PSA水平的升高,即生化復發(fā)。由于前列腺癌分子水平存在異質性,PSA水平、Gleason水平及病理分級相當的患者具有不同的臨床預后。因此,發(fā)現更有效的前列腺癌診斷標記物是非常迫切的,對前列腺癌發(fā)病分子機制進一步研究,發(fā)現新的有效的治療手段,減少腫瘤的復發(fā)與轉移,具有重要的

3、科學意義。
　　miRNA是一組保守的非編碼小RNA(non-coding small RNA),長約22nt的非編碼的單鏈RNA分子,廣泛分布在病毒、植物到高等哺乳動物中,大約相當于每種生物體蛋白編碼基因的1%。目前,miRNA已知的功能是在轉錄后水平調控基因的表達,主要作為基因表達的負調控因子,作用方式有兩種,一種是通過抑制靶基因的翻譯,另一種是促進目標mRNA的降解。哺乳動物中主要以抑制靶基因的翻譯的方式起作用,即miRNA

4、在腫瘤中異常表達,并通過對下游靶基因調控,在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中行使著重要的癌基因或抑癌基因的功能。
　　前列腺癌跟其他腫瘤一樣,miRNA的表達水平有其特異性。2007年,Porkka等人第一次對前列腺癌的miRNA特異表達水平作了報道,他們發(fā)現相比癌旁正常組織,前列腺癌組織中有37個miRNA表達下調,14個表達上調。2011年,我們自己也做了前列腺癌miRNA表達譜研究,發(fā)現上調11個,下調17個,相關的結果已經上傳到GEO數據

5、庫中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/,accessionnumberGSE34932)。miR-224是其中下調明顯的miRNA分子之一。既往研究表明,mir-224在許多腫瘤中起著調控細胞增殖或凋亡的促癌基因作用,mir-224在這些腫瘤中的表達是增高的,其中就包括結腸直腸癌、肝癌和腎癌。另一方面,mir-224在卵巢癌和口腔癌中的表達是下調的。MiR-224與前列腺癌的周圍神經浸潤有關。它也參與腫瘤

6、的發(fā)病進程。MiR-224在人基底樣乳腺癌上皮細胞表達,它可以抑制癌細胞增殖和侵襲,發(fā)揮著抑癌基因的作用。MiR-224可以對間充質干細胞向癌細胞的發(fā)展有抑制作用。然而miR-224在前列腺癌的表達、對細胞功能調控及其與臨床的預后尚不清楚。因此,我們研究miR-224對前列腺癌細胞功能的影響及其中的調控關系,闡明其在前列腺癌發(fā)病進程的作用及潛在的臨床意義。
　　本研究擬利用QRT-PCR、原位雜交和免疫組化等技術,檢測前列腺癌細胞

7、及臨床樣本中miR-224與TRIB1的表達情況,進一步闡明miR-224與TRIB1在前列腺癌細胞中的關系。利用基因克隆技術使miR-224表達增加,分析前列腺癌細胞中TRIB1的表達情況以及細胞增殖、侵襲、轉移和凋亡能力的變化。進而結合臨床樣本資料分析miR-224與TRIB1對前列腺癌臨床特征、進展及預后的影響。總之,我們的研究結果將為診斷前列腺癌提供新的標記物。
　　方法:
　　2.1、患者及資料
　　原位雜交

8、及免疫組化均為2003年到2012年廣州市第一人民醫(yī)院泌尿外科根治術的或者經尿道前列腺電切術切下的樣本。本次研究病理樣本取自兩個隊列。原位雜交及免疫組化的前列腺癌樣本各114例,癌旁良性組織均為20例。
　　2.2、免疫組織化學
　　TRIB1單克隆抗體(Abcam)的稀釋倍數為1:100。所有組織標本均用10%中性甲醛溶液固定,石蠟包埋,切割成厚4um的切片。采用過氧化氫標記的鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化氫酶法(SP法)進行

9、TRIB1的免疫組化染色。
　　2.3、原位雜交
　　采用地高辛標記LNA-miR-探針用于檢測組織中特異表達量;使用DIG3*末端寡核苷酸標記試劑盒。
　　2.4、QRT-PCR
　　抽提細胞和組織的microRNA,逆轉錄成cDNA后,采用SYBRgreen法進行PCR擴增,通過相對定量以2一△△CT值代表基因的相對表達強度。
　　2.5、熒光素酶報告實驗
　　構建TRIB1基因3'非翻譯區(qū)(3'

10、-UTR)熒光素酶報告基因融合質粒(pMIR-TRIB1),并與pSilencer-miR-224共轉染DU145細胞,通過雙熒光素酶活性檢測,確定miR-224對TRIB13'-UTR的作用位點。
　　2.6、細胞增殖實驗(MTT)
　　用培養(yǎng)液配成單個細胞懸液,以每孔1000-10000個細胞接種到96孔板,每孔體積200ul。培養(yǎng)24h、48h及72h后,每孔加CCK8溶液20ul。繼續(xù)孵育4小時,終止培養(yǎng),離心后再吸

11、棄孔內培養(yǎng)上清液。每孔選擇490nm波長,在酶聯免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值,記錄結果,以時間為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。
　　2.7、細胞凋亡實驗
　　AnnexinV—FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡:用PBS洗滌細胞2次(2000r/min,離心5min)收集(1-5)×105個細胞,吸取250ul的2×BindingBuffer緩沖液和250ul ddH20,混勻;用上述500ul的l×Binding

12、 Buffer緩沖液懸浮細胞;加入5ul Annexin V-FITC混勻后加入5ul碘化丙啶(PI),然后混勻;加入BQl23,室溫避光反應15min;用流式細胞儀(BD FACSArial I cell sorter,BD Biosciences)檢測[激發(fā)波長(Ex)=488nm;吸收波長(Em)=530nm]細胞凋亡情況。
　　2.8、細胞侵襲實驗(Transwell invasion assay)
　　按照Chem

13、icon公司的ECM550系列說明書要求,將小室放入培養(yǎng)板中,在上室加入300μl預溫的無血清培養(yǎng)基,室溫靜置15-30分鐘,基質膠水化。再吸去剩余培養(yǎng)液。細胞饑餓12-24h,消化細胞,制備細胞懸液,接種細胞,培養(yǎng)48h,再拍照及細胞計數。
　　2.9、細胞轉移實驗(wound healing)
　　取對數生長期的細胞,置于24孔板,細胞密度8x104/孔,每組設三個復孔,待細胞呈現單層貼壁生長時,用10ul的消毒槍頭在2

14、4孔板垂直劃痕,并劃好標記,然后用無血清培養(yǎng)基洗2-3次,盡量將劃掉的細胞清洗掉,換無血清培養(yǎng)基,37度、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),于0h、48h在相差顯微鏡下隨機選擇5個40倍視野內測量劃痕面垂直距離。實驗重復三次。
　　2.10、western blot
　　MiR-224mimic轉染24h后.分別提取細胞的總蛋白,按照蛋白定量試劑盒說明書BCA法進行總蛋白定量,取50g蛋白質樣品進行SDS—PAGE凝膠電泳后將凝膠上

15、的蛋白轉移至膜上.標記預染的位置。50mg/L脫脂牛奶封閉,一抗為1:500稀釋的鼠抗人TRIB1抗體。4℃孵育過夜。TBST洗滌后以熒光素標記的兔抗鼠二抗避光室溫封閉lh后,在凝膠成像儀上掃描條帶。
　　統(tǒng)計學處理:
　　數據分析采用SPSSS17.0軟件(SPSSInc,Chicago,IL)。連續(xù)性變量資料采用表示,兩組資料的比較采用t檢驗或近似t檢驗。生存分析用Kaplan-Meier方法,以中位數(分別為3.29及

16、4.98)將miR-224及TRIB1平均染色強度分為低表達及高表達組,經log-rank檢驗生存時間或生化復發(fā)時間差異,COX風險比例回歸模型進行多變量分析。TRIB1與miR-224的相關性分析采用Spearman correlation。P<0.05被認為統(tǒng)計有顯著意義。
　　結果:
　　4.1、miR-224在前列腺癌細胞及組織中下調表達
　　我們行前列腺組織miRNA芯片結果表明,相比癌旁正常前列腺組織,mi

17、R-224在前列腺癌組織中是下調比較顯著的miRNA分子(Fold change=3.32,P=0.01)。采用qRT-PCR技術分析,miR-224在前列腺癌組織中的表達下調。我們還對前列腺的正常和腫瘤細胞行qRT-PCR驗證其miR-224的表達水平,結果發(fā)現同正常人類前列腺細胞PrEC相比,人類前列腺癌細胞DU145、LNCaP和PC3細胞中的miR-224表達明顯下調。
　　4.2、TRIB1是miR-224的靶基因

18、>　　為進一步研究miR-224在前列腺癌細胞中的調節(jié)機制,我們利用生物信息學工具(miRGen,TargetScan,Pictar,miRWalk,miRDB and miRanda)預測出miR-224的潛在靶基因。其中TRIB1同時在3個預測軟件中出現(Pictar,miRDB,and miRanda)。我們通過利用腺病毒轉染體系,構建了穩(wěn)定的miR-224高表達DU145和LNCaP細胞株。Western blot實驗結果表明T

19、RIB1的表達水平在miR-224高表達的細胞株中明顯下調。運用miR-224mimic及陰性對照(NC)轉染前列腺癌細胞株DU145,作用24h后Westernblot實驗發(fā)現,miR-224的過表達導致TRIB1蛋白表達下調,以β-atcin標準,蛋白的相對定量表達值有顯著差異(t=-15.32,P<0.001)。熒光素酶報告實驗進一步驗證miR-224可作用于TRIB13'-UTR靶點,抑制TRIB1蛋白的翻譯,從而降低DU145

20、細胞中TRIB1蛋白的水平。
　　4.3、miR-224通過調節(jié)靶基因TRIB1,抑制前列腺癌細胞的增殖、侵犯和轉移,促進凋亡。
　　我們利用miR-224高表達DU145和LNCaP細胞株模型研究miR-224對前列腺癌細胞的增殖、侵犯、轉移及凋亡能力的影響。采用細胞增殖實驗檢測miR-224上調表達對前列腺癌細胞株增殖的影響,結果表明,miR-224過表達可抑制前列腺癌細胞增殖。侵襲小室實驗(Tanswellassay)

21、發(fā)現miR-224表達上調可明顯降低DU145和LNCaP細胞的侵襲能力。劃痕試驗結果表明miR-224表達升高可明顯降低DU145和LNCaP細胞的轉移能力。相反,miR-224高表達的DU145和LNCaP細胞凋亡率明顯高于陰性對照組。
　　利用siRNA瞬轉技術構建TRIB1表達下調的DU145細胞,結果發(fā)現TRIB1表達下調后,上述的miR-224高表達DU145細胞株的低增殖、侵襲、轉移和高凋亡能力消失,即增殖、侵襲和轉

22、移能力增強,凋亡能力減弱。
　　4.4、miR-224及TRIB1蛋白表達在前列腺癌中顯著負相關
　　我們進一步行原位雜交和免疫組化染色,檢測前列腺癌組織和良性組織miR-224和TRIB1的的表達差異情況。根據染色評分,發(fā)現miR-224在114例前列腺癌組織的平均染色強度顯著低于20例良性組織(staining score:PCa=3.29±0.54 versus Benign=5.07±0.32,P<0.001);TR

23、IB1蛋白在前列腺癌組織的平均染色強度顯著高于良性組織(staining score:PCa=5.90±0.32 versus Benign=4.91±0.54,P<0.05)。根據兩者的表達水平,運用Spearman correlation發(fā)現miR-224及TRIB1蛋白顯著負相關(rs=-0.36,P<0.001)
　　4.5、前列腺癌組織miR-224及TRIB1蛋白同臨床病理特征密切相關
　　根據染色評分,發(fā)現mi

24、R-224同PSA水平(P=0.023)、臨床分期(P=0.03)、轉移(P=0.001)及生化復發(fā)(P=0.005)顯著相關,即PSA水平低組(<4(19))、病理分期低組(T2A-T2C)、無轉移、無生化復發(fā)的患者中的miR-224表達水平更高。TRIB1蛋白同轉移(P=0.042)、是否生存(P=0.040)及生化復發(fā)(P=0.005)顯著相關,及TRIB1蛋白在臨床分期高的表達水平高。
　　4.6、miR-224及TRIB

25、1蛋白表達可預測前列腺癌患者的臨床預后
　　MiR-224表達同無生化復發(fā)生存率顯著相關(P=0.017),即高表達組的生化復發(fā)時間顯著高于低表達組(BCR mean free time:High expression=110.73 months VS low expression=59.79months)。運用Kaplan-Meier分析方法發(fā)現TRIB1蛋白表達同無生化復發(fā)生存率顯著相關(P=0.016),TRIB1低表達患者

26、的平均生化復發(fā)時間顯著高于低表達組(BCR mean free time:Low expression=92.66 months versus High expression 69.74 months)。
　　采用用Cox回歸模型(cox regression)進行單因素及多因素的綜合分析,在miR-224原位雜交的隊列中,單因素及多因素分析均表明,miR-224表達越低(P=0.001),Gleason score越高(P<0.

27、05),病理分期越高(P<0.001),則總體生化復發(fā)的風險越大。多因素分析采用enter法、向后逐步回歸法,表明miR-224(P<0.05)及Gleason score(P<0.05)是生化復發(fā)的獨立預后因素。在免疫組化TRIB1的隊列中,單因素分析結果表明TRIB1(P=0.021)、Gleason評分(P<0.001)及病理分期(P<0.001)是患者無生化復發(fā)生存的顯著預后因素,即TRIB1表達水平越高、Gleason評分越高

28、病理分期越高的患者越容易生化復發(fā)。然后我們運用COX風險比例回歸模型進行多因素分析,采用強迫進入法(Enter)、向后逐步回歸法(Backward stepwise)均表明TRIB1(P<0.05)、Gleason score(P<0.05)及術前病理分期(P<0.05)是生化復發(fā)的獨立預后因素,即TRIB1表達越高、Gleason評分越高及病理分期越高的患者發(fā)生生化復發(fā)的風險越高。
　　結論:
　　5.1、miR-224在