小分子RNA-195通過(guò)負(fù)性調(diào)控S6K1的表達(dá)抑制人類(lèi)前列腺癌的進(jìn)展.pdf_第1頁(yè)
已閱讀1頁(yè),還剩149頁(yè)未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶(hù)提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

1、目的:
  本研究旨在探索miR-195在前列腺癌中的作用及其調(diào)控的靶基因。
  材料:
  1.人臨床組織來(lái)源:12對(duì)配對(duì)的原發(fā)性前列腺癌及癌旁良性冰凍前列腺組織從廣州市第一人民醫(yī)院組織庫(kù)獲得。
  2.動(dòng)物:20只年齡在4-5周的BALB/c雄性裸鼠購(gòu)買(mǎi)于廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
  3.細(xì)胞株:3種前列腺癌細(xì)胞株(PC3/DU145/LNCaP)是2012年從美國(guó)馬納薩斯(Manassas,VA,USA

2、)的American Type Culture Collection(ATCC)公司購(gòu)買(mǎi)得到,而良性的前列腺上皮細(xì)胞系PrEC是從Lonza公司購(gòu)買(mǎi)。
  方法:
  1.慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染DU145和LNCaP構(gòu)建miR-195過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)的細(xì)胞株;核酸或質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染DU145和LNCaP構(gòu)建靶基因S6K1、miR-195和靶基因S6K1同時(shí)過(guò)表達(dá)等細(xì)胞株。
  2.Taylor公用數(shù)據(jù)庫(kù)分析miR-195的表達(dá)

3、水平與人前列腺癌的臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。
  3.細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)分析miR-195在體外對(duì)前列腺癌細(xì)胞功能的影響,以及靶基因S6K1能否拮抗miR-195對(duì)前列腺癌細(xì)胞引起的效應(yīng),包括細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)。裸鼠皮下接種DU145和LNCaP細(xì)胞株形成裸鼠皮下移植瘤模型,用于分析miR-195在體內(nèi)對(duì)前列腺癌成瘤和轉(zhuǎn)移方面的影響。
  4.iTRAQ技術(shù)對(duì)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-195和空白對(duì)照的LNCaP

4、細(xì)胞株進(jìn)行質(zhì)譜分析,探索由miR-195引起的差異表達(dá)的蛋白。結(jié)合IPA軟件和GO功能分析差異蛋白所涉及的信號(hào)通路和分子生物學(xué)功能。
  5.miRNAs靶基因預(yù)測(cè)軟件Target-Scan、miRWalk和miRanda同時(shí)預(yù)測(cè)受miR-195調(diào)控的靶基因;熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)確認(rèn)miR-195直接調(diào)控的靶基因。
  6.qRT-PCR檢測(cè)miR-195過(guò)表達(dá)和空白對(duì)照的LNCaP細(xì)胞株中候選靶基因S6K1、SMAP2、DCU

5、N1D1、SMAD4、IPO9、CAPZA2和 CPNE1的表達(dá)水平。qRT-PCR分別檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3、DU145和LNCaP,正常前列腺上皮細(xì)胞株P(guān)rEC,以及12對(duì)前列腺癌和對(duì)應(yīng)的癌旁良性前列腺組織的miR-195和靶基因S6K1的表達(dá)水平。
  7.Western bolt檢測(cè)miR-195異常表達(dá)的DU145和LNCaP細(xì)胞株以及裸鼠皮下移植瘤組織中靶基因S6K1的蛋白水平;Western bolt檢測(cè)靶基因S6

6、K1表達(dá)異常的相關(guān)細(xì)胞株構(gòu)建是否成功;Western bolt檢測(cè)miR-195過(guò)表達(dá)或S6K1被抑制表達(dá)的DU145和LNCaP細(xì)胞株中靶基因S6K1下游已被研究證實(shí)的潛在效應(yīng)因子MMP-9、VEGF、BAD和E-cadherin的蛋白水平。
  8.免疫組織化學(xué)分析S6K1在包含225例人前列腺癌和25例癌旁良性前列腺癌的組織芯片的表達(dá)情況;免疫組織化學(xué)分析miR-195異常表達(dá)的DU145和LNCaP細(xì)胞株接種形成的裸鼠皮下

7、腫瘤組織中CD31和Vimentin的表達(dá)情況。
  結(jié)果:
  1.相對(duì)正常前列腺上皮細(xì)胞株P(guān)rEC,miR-195在PC3、DU145和LNCaP細(xì)胞株中的表達(dá)量均顯著性下調(diào)(P<0.001); miR-195在人臨床前列腺癌組織中的表達(dá)量相對(duì)于癌旁良性前列腺組織的表達(dá)量同樣顯著性下調(diào)(P=0.020)。
  2.利用Taylor公用數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示miR-195的表達(dá)水平跟前列腺癌Gleason評(píng)分成顯著性負(fù)相關(guān)(

8、P=0.001),miR-195表達(dá)水平的下調(diào)與前列腺癌根治術(shù)后發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及生化復(fù)發(fā)密切相關(guān)(P=0.01,0.009),然而,miR-195的表達(dá)水平與患者的術(shù)前血清PSA濃度、腫瘤臨床分期、腫瘤病理分期以及是否死亡不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性。Kaplan-Meier和Log rank方法顯示miR-195的表達(dá)水平與患者的總體生化復(fù)發(fā)率和無(wú)轉(zhuǎn)移生化復(fù)發(fā)率存在顯著性負(fù)相關(guān)(P=0.001,0.009),但與患者的總體生存率和無(wú)轉(zhuǎn)移生存

9、率不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性(P=0.721,0.806)。COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型單因素分析結(jié)果提示腫瘤病理分期、Gleason評(píng)分和miR-195的表達(dá)水平都是預(yù)測(cè)前列腺癌患者接受前列腺癌根治術(shù)后出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)的重要指標(biāo),而年齡、術(shù)前血清PSA水平、腫瘤臨床分期不能作為判斷前列腺癌預(yù)后的預(yù)測(cè)因子。COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析結(jié)果提示miR-195表達(dá)水平[HR:0.58(0.39-0.85)]、Gleason評(píng)分[HR:5.83(2.

10、71-12.54)]和病理分期[2.71(1.09-6.71)]能夠作為預(yù)測(cè)生化復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立指標(biāo)。
  3.體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)顯示miR-195過(guò)表達(dá)的DU145和LNCaP細(xì)胞株的增殖、遷移、侵襲能力相對(duì)空白對(duì)照組明顯下降,而發(fā)生凋亡的比率明顯增加。相反,miR-195抑制表達(dá)的DU145和LNCaP細(xì)胞株的增殖、遷移、侵襲能力相對(duì)對(duì)照組明顯增加,而發(fā)生凋亡的比率明顯降低(P<0.05)。
  4.裸鼠皮下移植瘤模型顯示m

11、iR-195過(guò)表達(dá)能夠顯著性抑制由DU145和LNCaP形成的移植瘤的成瘤大小和生長(zhǎng)速度(P<0.05);相反,miR-195的表達(dá)被抑制后移植瘤成瘤大小比對(duì)照組大,且生長(zhǎng)速度加快。免疫組化分析結(jié)果顯示miR-195能夠顯著性抑制移植瘤組織中新生血管指標(biāo)CD31和腫瘤侵襲力指標(biāo)Vimentin的表達(dá)水平(P<0.05)。
  5.iTRAQ發(fā)現(xiàn)的差異性表達(dá)蛋白總共有3194個(gè),其中有78個(gè)蛋白的差異表達(dá)倍數(shù)≤-1.5或≥1.5(m

12、iR-195 vs miR-NC),包括28個(gè)上調(diào)蛋白和50個(gè)下調(diào)蛋白。IPA軟件的KEGG通路分析顯示大部分上調(diào)蛋白參與代謝類(lèi)的通路,例如檸檬酸循環(huán)、纈氨酸降解、丙氨酸生物合成、輔酶生物合成和脂肪酸氧化。大部分下調(diào)的蛋白參與mTOR通路、IL-8通路、AMPK通路和IGF-1通路等腫瘤相關(guān)通路。GO功能會(huì)聚系統(tǒng)分析結(jié)果顯示差異蛋白涉及的與腫瘤相關(guān)的生物學(xué)功能包括細(xì)胞周期、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。
  6.3個(gè)miRNA

13、s靶基因軟件共同預(yù)測(cè)50個(gè)下調(diào)蛋白中可能被miR-195調(diào)控的候選靶基因,結(jié)果顯示SMAP2、DCUN1D1、SMAD4、IP09、S6K1、CAPZA2和CPNE1為候選靶基因。qRT-PCR結(jié)果顯示SMAP2、S6K1、IP09和DCUN1D1在miR-195過(guò)表達(dá)的LNCaP細(xì)胞株和裸鼠皮下移植瘤組織中表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)一步揭示S6K1是miR-195直接調(diào)控的靶基因(P<0.001)。 qRT-PCR和

14、western blot證實(shí)miR-195和S6K1在前列腺癌細(xì)胞株、移植瘤和人臨床前列腺癌組織中的基因和蛋白表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系。
  7.體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)示S6K1過(guò)表達(dá)可以拮抗miR-195對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用,以及減緩miR-195對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用(P<0.05)。另外,siRNA抑制S6K1的表達(dá)后在體外對(duì)前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡功能的影響與miR-195對(duì)前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)一

15、致(P<0.05)。這些結(jié)果進(jìn)一步揭示了S6K1可能是miR-195發(fā)揮抑制前列腺癌進(jìn)展作用下游重要的媒介。
  8.組織芯片免疫染色分析顯示前列腺癌組織標(biāo)本的S6K1陽(yáng)性表達(dá)率[174/225(77.3%)]顯著高于癌旁良性前列腺組織[10/25(40%)](x2=16.140,P<0.001); S6K1的陽(yáng)性表達(dá)與前列腺癌患者的病理分期較晚(x2=4.396,P=0.036)、手術(shù)切緣陽(yáng)性(x2=5.371,P=0.02)、

16、生化復(fù)發(fā)(x2=5.696,P=0.017)和總體生存率降低(x2=5.417,P=0.02)有關(guān)。Kaplan-Meier和Log rank方法分析結(jié)果顯示S6K1的陽(yáng)性表達(dá)跟患者總體無(wú)生化復(fù)發(fā)生存率和總體生存率降低有關(guān)(P=0.011,0.022),但與無(wú)轉(zhuǎn)移生存率的降低不存在相關(guān)性(P=0.058)。
  COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型顯示S6K1可作為預(yù)測(cè)前列腺癌患者無(wú)生化復(fù)發(fā)生存率和總體生存率的獨(dú)立指標(biāo),HR(95% CI)分別

17、是2.041(1.098-3.792)和2.992(1.058-8.462)。
  9.在前列腺癌細(xì)胞株LNCaP和DU145中,抑制S6K1的表達(dá)或miR-195過(guò)表達(dá)均可以導(dǎo)致MMP-9和VEGF的蛋白水平下降,而E-cadherin和BAD的蛋白水平上調(diào),這結(jié)果說(shuō)明MMP-9、VEGF、E-cadherin和BAD是miR-195-S6K1軸下游的重要效應(yīng)因子。
  結(jié)論:
  1.miR-195在前列腺癌中是一

18、個(gè)重要的抑癌基因;miR-195通過(guò)負(fù)性調(diào)控S6K1的表達(dá)抑制人類(lèi)前列腺癌的進(jìn)展。
  2.miR-195和S6K1均可單獨(dú)作為預(yù)測(cè)患者在接受前列腺癌根治術(shù)后出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo);S6K1還可單獨(dú)作為預(yù)測(cè)前列腺癌患者總體生存時(shí)間長(zhǎng)短的指標(biāo)??傊型ㄟ^(guò)檢測(cè)前列腺癌組織中miR-195和S6K1的表達(dá)水平,協(xié)助傳統(tǒng)的臨床病理指標(biāo)更準(zhǔn)確地區(qū)分低度惡性和高度惡性的前列腺癌,優(yōu)化治療方案。
  3.miR-195-S6K1信號(hào)軸

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶(hù)所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶(hù)上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶(hù)上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶(hù)因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論