前列腺癌AR復合體通過甲基化抑制YAP1的表達.pdf

1、目的：應用體內體外實驗檢測前列腺癌中雄激素受體（AR）對 Yes相關蛋白1（Yes-associated protein1, YAP1）的調節(jié)作用，并進一步探討AR調節(jié)YAP1的作用機制。
　　方法：應用免疫組織化學的方法分別檢測三個時間點兩種轉基因鼠（ AR-wt AR-KO）的YAP1的表達差異，應用蛋白免疫印跡（Western Blotting）的方法分別檢測前列腺癌細胞中抑制AR（使用AR的抑制劑）和激活AR（過表達AR）

2、后YAP1蛋白表達的變化，應用IHC及Western Blotting兩種技術分別檢測不同的人前列腺疾病標本（BPH、ADPC、CRPC）的 YAP1的表達差異。應用實時定量PCR技術（qPCR）的方法檢測敲低AR（通過siRNA）后YAP1及其下游基因的mRNA變化，應用Luciferase報告基因技術分別檢測抑制AR（通過siRNA敲低AR以及使用AR的抑制劑兩種不同的方法）和激活AR后YAP1的啟動子區(qū)活性。應用甲基化特異性PCR

3、（MSP）的方法檢測雄激素依賴的AR對YAP1啟動子區(qū)甲基化的調節(jié)作用。應用蛋白免疫印跡、qPCR和Luciferase報告基因技術分析依賴AR的DNA甲基轉移酶3a(DNMT3a)對YAP1的調節(jié)作用。應用染色質免疫沉淀技術（ChIP-MSP）驗證 DNMT3a、AR對 YAP1的甲基化的調節(jié)作用。應用免疫共沉淀技術（CoIP）、染色質免疫共沉淀技術（ChIP-qPCR）驗證AR、DNMT3a、EZH2三者的相互作用及其調節(jié)YAP1的

4、機制。
　　結果：⑴前列腺癌中AR抑制YAP1的表達。人前列腺組織中，YAP1主要表達于AR陰性、CK5陽性的基底上皮細胞（basal epithelial cells）的核內，而高表達AR的腔上皮細胞（luminal cells）則表達極少量的細胞內彌散分布的YAP1。去勢抵抗性前列腺癌（ CRPC）中 YAP1的表達明顯高于激素依賴性前列腺癌（ADPC）。⑵qPCR結果證實敲低AR后，YAP1及其下游基因的mRNA上調。Luc

5、iferase報告基因實驗證實抑制AR能提高YAP1的啟動子區(qū)活性，而雙氫睪酮（DHT）刺激AR能抑制YAP1的啟動子區(qū)活性。⑶MSP結果顯示DHT激活AR后，YAP1啟動子區(qū)CpG位點的甲基化水平上調，繼而用MDV3100抑制AR活性后，上調的甲基化回落。⑷DNMT3a在轉錄水平抑制YAP1的表達，這種抑制作用有賴于雄激素激活的AR，同時AR抑制YAP1的轉錄亦依賴DNMT3a，進一步的ChIP-MSP實驗證實，相比于非甲基化位點，D

6、NMT3a和AR更多地結合在YAP1的啟動子區(qū)甲基化位點。⑸CoIP實驗證實AR、DNMT3a、EZH2互相結合形成復合體，ChIP-qPCR實驗進一步證實AR-DNMT3a-EZH2復合體結合于YAP1的啟動子區(qū)，并且這種結合是雄激素依賴性的。EZH2的抑制劑 DZNep能抑制復合體的形成與發(fā)揮作用，相反地，H3K27去甲基化酶抑制劑GSKJ1能促進復合體的形成與發(fā)揮作用。
　　結論：前列腺組織中，YAP1主要表達于基底上皮細胞

7、的核內，而腔上皮細胞則表達少量的細胞內彌散分布的YAP1。CRPC中YAP1的表達明顯高于ADPC。前列腺癌中AR能夠抑制YAP1的表達，并且這種抑制作用依賴于AR與DNMT3a、EZH2相互結合形成復合體，此復合體結合于YAP1的啟動子區(qū)，繼而促進YAP1的啟動子區(qū)CpG位點的甲基化。CRPC階段，AR、DNMT3a和EZH2對YAP1的甲基化調節(jié)過程明顯抑制，從而導致YAP1高表達，此過程對CRPC階段前列腺癌細胞的生長至關重要，這