CD147的表達(dá)與前列腺癌進(jìn)展的關(guān)系和甲基化的初步研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 前列腺癌是一種常見的男性泌尿系統(tǒng)腫瘤，并且在美國的男性腫瘤死亡率排名第二[1]。雖然局限性前列腺癌患者在成功地接受根治性前列腺切除術(shù)或者放射性治療后能夠獲得良好的治療效果，但是前列腺癌患者往往死于激素難治性腫瘤和腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在實(shí)際的臨床工作中，由于各種客觀原因以及缺乏特異性的診斷標(biāo)準(zhǔn)，使泌尿外科醫(yī)生對于辨別哪部分前列腺癌患者術(shù)后可能出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展、腫瘤復(fù)發(fā)，需要及時給予進(jìn)一步的輔助治療這個問題上產(chǎn)生一定的

2、困難。前列腺癌患者的預(yù)后情況根據(jù)腫瘤的臨床分期和病理分級呈現(xiàn)多種的變化。許多科研人員希望尋找前列腺癌的特異性分子標(biāo)記物來幫助臨床醫(yī)生解決臨床上所遇到的困境。研究發(fā)現(xiàn)許多敏感度高的新型前列腺癌分子標(biāo)記物與腫瘤的生物學(xué)侵襲行為有關(guān)，并且能夠?qū)膊〉脑\斷和治療產(chǎn)生重要的臨床價值?，F(xiàn)階段，如何有效地治療前列腺癌的轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為前列腺癌治療方法的一個重要難題[2]。最近，許多研究的焦點(diǎn)集中在如何利用各種預(yù)測前列腺癌預(yù)后情況的臨床指標(biāo)來建立一個診斷模

3、型準(zhǔn)確地提供必要的臨床信息[3-5]。前列腺癌腫瘤細(xì)胞根據(jù)其所屬種類具有高度或者低度的腫瘤轉(zhuǎn)移潛能，包括細(xì)胞分化、細(xì)胞間粘附、細(xì)胞侵襲力和細(xì)胞運(yùn)動力。這些促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的因素都是正常機(jī)體細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變過程中相應(yīng)基因改變的結(jié)果。因此，尋找和發(fā)現(xiàn)一個能夠準(zhǔn)確地預(yù)測前列腺癌進(jìn)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的新型分子標(biāo)記物將會使我們進(jìn)一步地了解前列腺癌的潛在機(jī)制，為前列腺癌患者提供更有效的靶向治療，達(dá)到更好的治療效果。細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)劑，又叫CD14

4、7，是一類相對分子質(zhì)量為50000-60000屬于免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily，IGSF)的跨膜糖蛋白。CD147分子在人體內(nèi)分布非常廣泛，參與炎癥反應(yīng)、精子發(fā)生、胚胎發(fā)育等各種不同的生理過程。不僅如此，CD147分子已經(jīng)被廣泛證實(shí)在多種惡性腫瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)[6]。研究發(fā)現(xiàn)CD147通過誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)金屬酶（MMPS）的合成參與腫瘤的轉(zhuǎn)移和增強(qiáng)腫瘤的侵襲力。腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是多步驟的復(fù)雜過程，

5、包括基底膜降解、基質(zhì)滲透以及腫瘤細(xì)胞進(jìn)出血管和對靶組織的侵襲。其中腫瘤周圍基底膜的降解是腫瘤細(xì)胞向鄰近纖維結(jié)締組織浸潤進(jìn)而向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中最基本的一步。所有這些都要求由MMPS等蛋白水解酶來介導(dǎo)基底膜組成成分和細(xì)胞外基質(zhì)大分子的重塑。除此以外，CD147增強(qiáng)腫瘤侵襲性的途徑包括激活ERK1/2和p38絲裂原活化蛋白酶通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化，通過PI3K-Akt信號旁路來調(diào)節(jié)血管生長因子(VEGF)的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤內(nèi)血管生長，通過產(chǎn)生透明

6、質(zhì)烷增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞抵抗化療藥物的能力和通過抑制Bim加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞抵抗堿性環(huán)境的能力[7-11]門。還有文獻(xiàn)報道，抑制CD147的表達(dá)可以激活半胱天冬酶-3，從而降低細(xì)胞的穩(wěn)定性和導(dǎo)致DNA斷裂[10]。另外，CD147的表達(dá)與乳腺癌、黑色素瘤、肝癌等腫瘤的臨床預(yù)后相關(guān)[2,13,14]。Zou W等使用RNA干擾技術(shù)抑制CD147的基因表達(dá)不但可以降低腫瘤的侵襲力和惡性程度，還可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對紫杉醇類化療藥物的敏感性[15]。雖然關(guān)于C

7、D147在腫瘤進(jìn)展過程中的作用已經(jīng)引起腫瘤學(xué)界的關(guān)注，但是關(guān)于CD147與良性前列腺增生、腫瘤轉(zhuǎn)移病變和不同前列腺癌分期的之間的聯(lián)系，特別是CD147的表達(dá)與無PSA生化復(fù)發(fā)生存率、無腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率的關(guān)系仍然未有相關(guān)的報道。本次研究主要對240例確診為前列腺癌的石蠟組織標(biāo)本進(jìn)行CD147的免疫組化分析，每例前列腺癌標(biāo)本都有明確的Gleason評分和詳細(xì)的臨床病理資料。我們利用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理分析CD147表達(dá)與所有病例的無PSA生化復(fù)發(fā)生

8、存率，無腫瘤轉(zhuǎn)移生存率和總體生存率之間的關(guān)系，揭示CD147在腫瘤進(jìn)展過程中所起的重要作用。研究目的在于說明CD147參與前列腺癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等不良預(yù)后過程和證明CD147是否能夠成為一個預(yù)測前列腺癌生化復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移進(jìn)展和預(yù)期壽命的獨(dú)立指標(biāo)。另外，當(dāng)正常的前列腺組織發(fā)生癌變時，細(xì)胞可能發(fā)生許多分子水平上的異常，如基因啟動子甲基化異常、促癌基因的高表達(dá)等，根據(jù)表觀遺傳調(diào)控在腫瘤發(fā)病中的理論研究基礎(chǔ)，我們也在本課題中對CD147的甲基化情況進(jìn)行

9、初步的探討，驗(yàn)證甲基化修飾水平是否能夠調(diào)控CD147在前列腺癌中的表達(dá)。
　　 材料:
　　 臨床病例
　　 從1993年至1995年期間，共240名前列腺癌患者在哈佛醫(yī)學(xué)院附屬麻省總醫(yī)院(MGH，Boston，MA)接受根治性前列腺切除術(shù)治療，術(shù)后前列腺癌組織制作成石蠟切片后納入本次研究中。凡是在術(shù)前或者術(shù)后曾經(jīng)接受雄激素治療或者放射性治療的病例均被排除在實(shí)驗(yàn)組外。所有實(shí)驗(yàn)組前列腺癌組織標(biāo)本均經(jīng)過H-E染色并由

10、病理科醫(yī)生明確診斷。病理科醫(yī)生根據(jù)現(xiàn)行的前列腺癌病理分級評分標(biāo)準(zhǔn)(International Society of Urological Pathology)[16]對全部240例標(biāo)本進(jìn)行Gleason評分，每例標(biāo)本中最高Gleason評分的前列腺癌部分均被用于制作前列腺癌組織芯片。每例標(biāo)本均記錄以下相關(guān)臨床數(shù)據(jù):年齡，術(shù)前PSA水平，Gleason評分，美國癌癥聯(lián)合委員會(American JointCommittee on Canc

11、er)病理腫瘤分期，手術(shù)切緣情況，PSA生化復(fù)發(fā)情況和時間，術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移情況和時間和總體生存時間。無PSA生化復(fù)發(fā)生存時間指手術(shù)當(dāng)天至首次發(fā)現(xiàn)連續(xù)兩次血清PSA水平升高之間的時間間隔;無腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存時間指手術(shù)當(dāng)天至首次發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移病灶之間的時間間隔;總體生存時間指手術(shù)當(dāng)天至隨訪結(jié)束或者患者死亡之間的時間間隔。用于甲基化研究的臨床病例，由廣州市第一人民醫(yī)院提供。我們的研究經(jīng)過麻省總醫(yī)院倫理委員會和中華人民共和國衛(wèi)生部批準(zhǔn)。
　　

12、 組織芯片制作
　　 病理科醫(yī)生使用手動組織芯片制作工具(Beecher Instruments，SilverSpring，MD)進(jìn)行前列腺癌組織芯片的制作。首先，240例前列腺癌標(biāo)本制作成石蠟切片后進(jìn)行H-E染色，病理醫(yī)生反復(fù)查看并確定每例標(biāo)本的Gleason評分，在每例標(biāo)本上標(biāo)記GS最高的位點(diǎn)。然后根據(jù)標(biāo)記，使用直徑0.6毫米的組織穿刺針從石蠟塊中抽取需要的樣本并按順序排列在玻片上。每塊玻片上都含有遠(yuǎn)離癌旁的正常前列腺組織

13、作為對照。另外，還有20例正常前列腺組織用作免疫組化分析的陰性對照。最后，組織芯片經(jīng)H-E染色后再次進(jìn)行確認(rèn)。
　　 方法:
　　 使用Real-time PCR和Western blot對各種良惡性前列腺細(xì)胞株進(jìn)行CD147表達(dá)水平的檢測;以不同濃度(0，2.5，5，7.5，10uM)的甲基化抑制藥物5-Aza-2'-deoxycytidine處理P69和PC3細(xì)胞，驗(yàn)證藥物處理后CD147表達(dá)水平的變化;使用甲基化特

14、異性檢測試劑盒，分別對細(xì)胞株及臨床石蠟樣本進(jìn)行CD147啟動子甲基化分析;最后對CD147表達(dá)陽性的前列腺癌標(biāo)本進(jìn)行焦磷酸測序，從基因測序方面直接對甲基化定性定量。240例石蠟標(biāo)本按照5微米的厚度進(jìn)行切片，使用二甲苯溶液脫蠟，重新水化后的組織芯片留待H-E染色或者免疫組化。經(jīng)過蛋白水解消化和過氧化酶封閉組織玻片等步驟后，加入濃度為1∶1000的一抗在4C環(huán)境中過夜孵育。經(jīng)過洗滌和二抗孵育后，在顯微鏡下觀察CD147的染色情況。確認(rèn)染色程

15、度滿意，使用蘇木紫溶液復(fù)染，封片。正常前列腺組織用作為陰性對照。每塊組織玻片分別由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生獨(dú)立觀察，所有關(guān)于臨床病理和治療效果的患者資料均對觀察者隱瞞。最后的觀察結(jié)果由兩位醫(yī)生進(jìn)行比對后確定，任何存在分歧的部分均重新觀察和討論后得出一致的結(jié)果。CD147表達(dá)陽性結(jié)果定義為在10個代表性顯微鏡下區(qū)域發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的表面或者細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)CD147表達(dá)。如果超過5％的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)CD147表達(dá)則定義為CD147陽性表達(dá)。
　　

16、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:統(tǒng)計(jì)學(xué)分析分別由兩位統(tǒng)計(jì)學(xué)專家使用SAS9.2版本(SAS Institute，Cary，NC)獨(dú)立完成，兩組結(jié)果經(jīng)過校對后確定最終結(jié)果。所有的連續(xù)變量均表示為X±s。所有四格表資料均使用Fisher精確檢驗(yàn)，非四格表記數(shù)資料使用Pearson卡方檢驗(yàn)。在單因素和多因素分析中，Cox比例危險模型用于計(jì)算CD147的表達(dá)與無PSA生化復(fù)發(fā)生存率、無腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率和總體生存率之間的關(guān)系。Kaplan-Meier法主要用于

17、生存曲線分析并經(jīng)過log-rank檢驗(yàn)。CD147表達(dá)情況與各種臨床數(shù)據(jù)之間的關(guān)聯(lián)使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和x2檢驗(yàn)方法驗(yàn)證。P＜0.05代表具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 CD147在前列腺癌患者腫瘤組織中的表達(dá)情況和位置
　　 我們使用中國第四軍醫(yī)大學(xué)生物研究中心提供的CD147抗體對前列腺癌組織芯片進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。CD147抗體主要聚集在前列腺癌細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，染色的程度分為低、中、高程度。前列腺癌組

18、織的CD147陽性表達(dá)率為47.08％[113/240]，而前列腺組織的CD147陽性表達(dá)率為5％[1/20]，二者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。我們對CD147陽性表達(dá)情況和相，關(guān)的各項(xiàng)臨床病理數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CD147的表達(dá)與Gleason評分(P=0.0002)，手術(shù)切緣腫瘤陽性(P＜0.0001)，無PSA生化復(fù)發(fā)生存率下降(P＜0.0001)，無腫瘤轉(zhuǎn)移生存率下降(P＜0.0001)和總體生存率下降(P＜0.00

19、02)存在重要聯(lián)系。在Kaplan-Meier生存分析中，CD147的陽性表達(dá)能夠降低無PSA生化復(fù)發(fā)生存率、無腫瘤轉(zhuǎn)移生存率和總體生存率。
　　 CD147的表達(dá)情況與手術(shù)效果之間的關(guān)系
　　 單因素分析表明CD147的表達(dá)和Gleason評分都可以作為前列腺患者無PSA生化復(fù)發(fā)生存時間、無腫瘤轉(zhuǎn)移生存時間和總體生存時間的重要預(yù)測指標(biāo)(P＜0.05)。分析也提示術(shù)前血清PSA水平(P＜0.001)，臨床病理分期(P=0

20、.0023)和手術(shù)切緣情況(P=0.0036)只能夠預(yù)測前列腺癌患者無PSA生化復(fù)發(fā)生存時間。多因素分析表明CD147的表達(dá)和Gleason評分均可以作為前列腺癌患者無PSA生化復(fù)發(fā)生存時間，無腫瘤轉(zhuǎn)移生存時間和總體生存時間的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)(P＜0.05)。另外，術(shù)前血清PSA水平只可以獨(dú)立預(yù)測無PSA生化復(fù)發(fā)時間，而臨床病理分期和手術(shù)切緣情況均對預(yù)測前列腺癌預(yù)后情況無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 CD147的表達(dá)情況與Gleason評分、

21、臨床病理分期之間的關(guān)系
　　 Gleason評分是至今為止判斷前列腺癌患者預(yù)后情況的最可靠指標(biāo)。本次研究中我們發(fā)現(xiàn)CD147的陽性表達(dá)率隨著G]eason評分的升高而上升。無論是單因素分析還是多因素分析都表明兩者是前列腺癌患者無PSA生化復(fù)發(fā)生存時間、無腫瘤轉(zhuǎn)移生存時間和總體生存時間的重要預(yù)測指標(biāo)。Kaplan-Meier生存曲線顯示在Gleason≤6和Gleason=7分組中，CD147的陽性表達(dá)與無PSA生化復(fù)發(fā)生存時間的

22、降低有關(guān)，但是在
　　 Gleason≥8分組中這種關(guān)系無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。至于總體生存率方面，CD147的表達(dá)在Gleason≤6分組中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.0160)。另外，Kaplan-Meier生存曲線顯示CD147的表達(dá)在高分期(pT3)(p＜0.0001和p=0.0028)和低分期(pT2)(p＜0.0001和p=0.0253)的病例中都與無PSA生化復(fù)發(fā)生存時間和總體生存時間有關(guān)。
　　 CD147啟動子甲基化

23、情況
　　 P69細(xì)胞經(jīng)過甲基化抑制藥物處理后，基因表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平隨著藥物濃度的增加呈現(xiàn)上升趨勢，而PC3細(xì)胞的CD147表達(dá)量并未發(fā)生明顯改變。P69和RWPE-1的甲基化檢測實(shí)驗(yàn)呈現(xiàn)陽性結(jié)果，說明CD147啟動子檢測序列中存在5個以上的甲基化CpG位點(diǎn)，而PC3等前列腺癌細(xì)胞株均呈現(xiàn)陰性結(jié)果。同樣，前列腺增生的甲基化檢測呈現(xiàn)陽性結(jié)果，而CD147表達(dá)陽性的前列腺癌標(biāo)本則呈現(xiàn)陰性結(jié)果。焦磷酸測序結(jié)果顯示3例前列腺癌標(biāo)本

24、（CD147表達(dá)陽性）啟動子區(qū)域的6個CpG位點(diǎn)甲基化修飾程度低，百分比均未超過10％。
　　 結(jié)論:
　　 1.與正常的前列腺細(xì)胞相比，CD147在前列腺癌中的表達(dá)明顯增強(qiáng)。
　　 2.CD147的表達(dá)與Gleason評分，手術(shù)切緣情況，血清PSA生化復(fù)發(fā)，術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤患者總體生存時間存在重要聯(lián)系。
　　 3.CD147表達(dá)陽性可能降低前列腺癌患者的無PSA生化復(fù)發(fā)生存率、無腫瘤轉(zhuǎn)移生存率和總體生

25、存率。
　　 4.CD147的表達(dá)情況可能作為除Gleason評分外的一個獨(dú)立判斷前列腺癌患者預(yù)后情況的預(yù)測指標(biāo)。
　　 5.CD147的表達(dá)不僅可以預(yù)測pT2期前列腺癌患者的無PSA生化復(fù)發(fā)生存率和總體生存率，而且也可以應(yīng)用于pT3期前列腺癌患者的預(yù)后判斷中。
　　 6.CD147的表達(dá)可以預(yù)測Gleason≤6的前列腺癌患者的無PSA生化復(fù)發(fā)生存率和總體生存率，但是不能應(yīng)用于高Gleason評分的患者中。