松花粉多糖酯化物對(duì)脾臟B淋巴細(xì)胞[Ca2+]i調(diào)控及抗體生成的影響.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果顯示,用熱水浸提60％乙醇沉淀提取的馬尾松花粉多糖(PPM60)經(jīng)硫酸酯化修飾后能明顯促進(jìn)小鼠脾臟混懸淋巴細(xì)胞的增殖,且硫酸酯化多糖(SPPM60)同脂多糖(LPS)都能顯著升高脾細(xì)胞[Ca2+]i及脾細(xì)胞上清中IL-2和IL-4的水平。同時(shí)證實(shí)了TOLL樣受體4(TLR4)是淋巴混懸細(xì)胞表面一個(gè)與SPPM60發(fā)揮作用相關(guān)的表面受體,并可以通過(guò)TLR4-PI3K-PLC信號(hào)通路引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。由于脾臟富

2、含T、B淋巴細(xì)胞,為了進(jìn)一步探明松花粉多糖及其酯化物對(duì)于脾臟T淋巴細(xì)胞具體作用機(jī)制,實(shí)驗(yàn)室前期還研究了SPPM60對(duì)分離純化的脾臟T淋巴細(xì)胞的作用,發(fā)現(xiàn)其能顯著促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖、[Ca2+]i的升高以及T淋巴細(xì)胞上清中IL-2和IL-4的水平,同時(shí)伴隨著T細(xì)胞內(nèi)PI3K-PLC-IP3R-Ca2+信號(hào)通路的激活,此外還證實(shí)了細(xì)胞外的鈣離子是通過(guò)CRAC通道大量?jī)?nèi)流而造成[Ca2+]i升高的。同時(shí)發(fā)現(xiàn),SPPM60對(duì)T細(xì)胞的活化作用并

3、不依賴于TLR4,猜測(cè)其可能是通過(guò)TCR/CD3來(lái)活化T細(xì)胞的。上述結(jié)果都顯示了SPPM60對(duì)脾臟混懸淋巴細(xì)胞和其中T淋巴細(xì)胞的作用,而目前仍沒(méi)有PPM60及SPPM60對(duì)脾臟B淋巴細(xì)胞作用的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從體外角度通過(guò)檢測(cè)PPM60組分之一(PPM60-D)酯化前后對(duì)B淋巴細(xì)胞增殖、[Ca2+]i和抗體生成的影響情況,從而研究PPM60-D酯化前后對(duì)B淋巴細(xì)胞的作用效果,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。實(shí)驗(yàn)主要分為以下幾個(gè)部分:

4、　　一、用熱水浸提乙醇沉淀法提取馬尾松花粉粗多糖,經(jīng)三氯乙酸法除去其中的蛋白質(zhì)后,分別用40%、60%、80%的乙醇對(duì)多糖進(jìn)行分級(jí)沉淀。本實(shí)驗(yàn)選取其中60%乙醇沉淀的多糖組分經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠柱層析對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步地分離純化,得到一種較均一的多糖組分,并將其命名為PPM60-D。稱取25mg的PPM60-D,用氯磺酸-吡啶法對(duì)其進(jìn)行硫酸酯化,得到硫酸酯化多糖SPPM60-D31.6mg。最后用氯化鋇-明膠比濁法測(cè)定SPPM60-D的取代度為

5、1.202。用紅外光譜檢測(cè)顯示其有S=O和C-O-S的特征吸收峰,表明PPM60-D硫酸酯化成功。
　　二、用尼龍毛纖維法分離小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞,MTT法分別檢測(cè)PPM60-D和SPPM60-D在不同作用濃度和時(shí)間下對(duì)B淋巴細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),200μg/mL的SPPM60-D在作用48 h時(shí),對(duì)小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞的促增殖效果最佳,達(dá)13.88%。
　　而PPM60-D對(duì)小鼠脾臟B細(xì)胞的增殖也有一定的作用,但效果較弱,

6、為7.13%。
　　三、用雙波長(zhǎng)熒光分光光度計(jì)檢測(cè)經(jīng)200μg/mL PPM60-D和SPPM60-D處理B淋巴細(xì)胞后[Ca2+]i的變化。與空白對(duì)照組相比PPM60-D和SPPM60-D都能使B淋巴細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i顯著升高,SPPM60-D的作用效果更強(qiáng)。2-APB、U73122和TAK-242能較大地抑制SPPM60-D引起的B淋巴細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i升高。LY294002和Verapamil也能部分抑制SPPM60-D所

7、引起的小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞[Ca2+]i的升高。而低分子肝素則能完全抑制SPPM60-D所引起的B淋巴細(xì)胞[Ca2+]i的升高,并且使B淋巴細(xì)胞[Ca2+]i低于空白對(duì)照水平。
　　四、利用溶血空斑實(shí)驗(yàn)(PFC)和定量溶血分光光度法(QHS)檢測(cè)SPPM60-D或PPM60-D刺激B細(xì)胞后,對(duì)其抗體生成的影響。結(jié)果表明無(wú)論是通過(guò)體外免疫,還是通過(guò)體內(nèi)免疫體外多糖刺激,200μg/mL的SPPM60-D都能顯著促進(jìn)B細(xì)胞的抗體生成水平

8、,并且在體外有較快的作用效果。而PPM60-D也能顯著促進(jìn)B細(xì)胞的抗體生成水平,但效果要比SPPM60-D弱。
　　以上結(jié)果表明:(1)PPM60-D和SPPM60-D都能顯著促進(jìn)小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞的增殖、[Ca2+]i的升高和抗體的生成,且SPPM60-D的作用效果要強(qiáng)于PPM60-D。(2)推測(cè)SPPM60-D促進(jìn)小鼠B淋巴細(xì)胞的增殖和抗體生成可能是通過(guò)提高其[Ca2+]i而造成的。(3)推測(cè)SPPM60-D所引起的小鼠脾臟B