馬尾松花粉多糖及其酯化物對脾細(xì)胞[Ca2+]i及細(xì)胞因子調(diào)控的研究.pdf

1、本實驗室前期研究表明，60％乙醇沉淀的馬尾松花粉多糖經(jīng)硫酸酯化后能促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，其升高的途徑至少有三種:通過膜表面的L-型鈣離子通道引發(fā)CICR；通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上IP3R介導(dǎo)的內(nèi)鈣釋放；通過膜上鈣庫調(diào)控的鈣通道調(diào)節(jié)。但是，硫酸酯化多糖作為一種分子量很大的化合物如何作用于細(xì)胞，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，目前尚不清楚。本實驗擬從體外的角度，對硫酸酯化馬尾松花粉多糖引起小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高的機(jī)理進(jìn)行初步探討，并對

2、其產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響進(jìn)行初步研究，明確硫酸酯化對松花粉多糖體外免疫增強作用的機(jī)理，以期為馬尾松花粉多糖的開發(fā)利用提供理論支持。實驗主要分為以下幾個部分。
　　一、60％乙醇沉淀的馬尾松花粉多糖(PPM60)的提取、純化及硫酸酯化:采用水煮醇沉法提取馬尾松花粉粗多糖，用Savage法重復(fù)幾次去除蛋白質(zhì)，用終濃度為40％、60％、80％乙醇分級沉淀，干燥稱重。選取60％乙醇沉淀組分用Sephacryl S-400HR對多糖進(jìn)行分離純化

3、及分子量測定，分離出三個組分，PPM60-A、PPM60-B、PPM60-C其分子量為1.44×105、1.2×105、7.26×104Dalton。對100mg PPM60進(jìn)行硫酸酯化修飾，得到暗黃色產(chǎn)物(SPPM60)128 mg。用氯化鋇-明膠比濁法測定取代度為1.2264。紅外光譜顯示已具有C-O-S和S=O的特征吸收峰，表明多糖已被成功硫酸酯化。
　　二、SPPM60對小鼠脾細(xì)胞增殖能力的影響:MTT法檢測不同濃度SPP

4、M60和PPM60作用不同時間對小鼠脾細(xì)胞增殖活力的影響。SPPM60在200?g/mL濃度下作用48h對小鼠脾細(xì)胞的促增殖率最高，達(dá)18。29％。而PPM60對小鼠脾細(xì)胞增殖作用較弱。經(jīng)SPPM60(200?g/mL)處理72 h后，細(xì)胞增殖速度顯著減慢。對于分離的三個組分及其酯化物，PPM60-A酯化后其促增殖能力最強，比酯化前增加了10.84％。
　　三、SPPM60對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca2+]i)的影響

5、:以Fura-2/AM為探針，熒光分光光度計檢測 SPPM60處理后[Ca2+]i的變化。SPPM60-A作用5 min內(nèi)，SPPM60-A組[Ca2+]i與對照組相比均顯著性升高。而TLR4的抑制劑TAK-242加入后再加SPPM60-A刺激，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i較單獨SPPM60-A組有顯著性降低，但未降到空白對照水平。LY294002(PI3K的抑制劑)能部分抑制SPPM60-A引起的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i升

6、高。此外PLC的抑制劑U73122能完全抑制SPPM60-A引起的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i升高。
　　四、PPM60及SPPM60對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響:用酶聯(lián)免疫吸附實驗法檢測SPPM60或PPM60刺激后脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IL-4的表達(dá)。結(jié)果SPPM60在200?g/mL條件下刺激48小時，脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IL-4的產(chǎn)生均有所升高，而加入TLR4的抑制劑TAK-242后，再加SPPM60

7、刺激，IL-2、IL-4的產(chǎn)生與空白對照相比沒有顯著性變化。PPM60對IL-2、IL-4的產(chǎn)生幾乎沒有影響。
　　以上結(jié)果表明:(1)PPM60對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞有較弱的增殖作用，硫酸酯化以后產(chǎn)生顯著性的促增殖作用。(2)SPPM60促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖可能是通過提高細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度來實現(xiàn)的。(3)SPPM60促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞[Ca2+]i升高與TLR4-PI3K-PLC信號通路有關(guān)。(4)SPPM60促進(jìn)小鼠脾臟