松花粉硫酸酯化多糖對大鼠動脈平滑肌細胞Ca2+調(diào)控及增殖的影響.pdf

1、多糖的分子修飾和結(jié)構(gòu)改造即利用糖殘基上的羥基、羧基、氨基等基團運用化學方法進行修飾，對提高多糖的生物活性具有重要意義。修飾的方法有很多，如硫酸化、羧甲基化、硒化、甲基化、氧化、部分水解、磷酸酯化、雙基團衍生化等。
　　目前，研究最多的是多糖的硫酸化修飾。多糖經(jīng)硫酸酯化修飾后富含 SO42-，易與蛋白質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)域結(jié)合，由此改變其構(gòu)象并影響其功能，使其活性增強或改變其原有活性。目前對于硫酸酯化多糖抗病毒、抗腫瘤、抗艾滋病等研究較多，

2、而對于防治心血管疾病方面卻鮮有報道。
　　本文以馬尾松花粉(Pinus massoniana pollen)為原材料，經(jīng)60％乙醇沉淀、Sevage法去蛋白后得到多糖(PPM60)，對其進行純化，各組分多糖用氯磺酸-吡啶法進行硫酸酯化修飾，得硫酸酯化多糖(SPPM60)，研究PPM60純化組分及其酯化多糖對大鼠動脈平滑肌細胞(VSMCs)內(nèi)游離鈣離子濃度的影響并探討其對細胞鈣離子濃度的可能調(diào)節(jié)機制，同時檢測其對VSMCs增殖的影響

3、，以探討馬尾松花粉多糖對心血管疾病防治的意義。
　　實驗具體分為五部分:
　　一、馬尾松花粉多糖的純化
　　馬尾松花粉多糖(PPM60)經(jīng) Sephacryl S-400HR層析后，最后得到四個組分，按洗脫體積大小即分子量大小依次命名為PPM60-A、PPM60-B、PPM60-C、PPM60-D。
　　二、馬尾松花粉多糖的硫酸酯化及鑒定
　　采用氯磺酸-吡啶法對多糖純化各組分進行硫酸酯化改性，得到硫酸酯化

4、多糖SPPM60-A、SPPM60-B、SPPM60-C及SPPM60-D。用氯化鋇-明膠比濁法鑒定硫酸根含量測定取代度。結(jié)果表明，得到的四種酯化多糖取代度分別為1.28、1.63、1.31、1.49。
　　三、大鼠動脈平滑肌細胞的原代培養(yǎng)
　　采用組織貼塊與酶解兩種方法原代培養(yǎng)大鼠動脈平滑肌細胞，成功摸索出較成熟的實驗方法。經(jīng)α-actin免疫組化分析鑒定其純度，取4-10代細胞進行多糖活性的測定。
　　四、各組分多

5、糖及酯化多糖對大鼠 VSMCs內(nèi)游離鈣離子濃度的影響
　　鈣離子熒光探針 Fura2/AM對平滑肌細胞進行負載后，采用雙波長熒光分光光度計檢測其胞內(nèi)游離鈣離子濃度，發(fā)現(xiàn) PPM60純化的各組分及其酯化多糖均能顯著降低鈣離子濃度，其中PPM60-A酯化前后對[Ca2+]i影響差異最大。用PPM60-A及SPPM60-A分別作用VSMCs，檢測其對高 K+、去甲腎上腺素(NE)升高胞內(nèi)鈣濃度的影響。結(jié)果顯示，PPM60-A及SPPM6

6、0-A均能抑制[Ca2+]i的升高。說明 PPM60-A及SPPM60-A可能通過細胞膜上的電壓依賴及受體操縱型鈣通道來降低VSMCs[Ca2+]i。高 K+預(yù)升高[Ca2+]i后，PPM60-A及SPPM60-A仍能在一定程度上降低胞內(nèi)鈣濃度。提示 PPM60-A及SPPM60-A還可能通過增加鈣庫貯存或促進鈣排出起到降低胞內(nèi)鈣濃度的作用。
　　五、PPM60-A、SPPM60-A對VSMCs增殖的影響
　　NE刺激 VS