葉籽銀杏microRNAs鑒定與表達分析.pdf

1、銀杏（Ginkgo biloba L.）屬于裸子植物門銀杏科銀杏屬，且單屬單種，系世界上現(xiàn)存最古老的樹種之一，在裸子植物中屬于原始類型。銀杏特殊的進化地位奠定了其在植物分類、系統(tǒng)進化、形態(tài)解剖、生物學等方面的突出研究價值。歷經(jīng)了漫長的歷史進化和人工栽植的干預，銀杏發(fā)生了明顯的變異，并根據(jù)銀杏葉片或種子的變異特征將銀杏劃分為不同品種。葉籽銀杏（Ginkgo biloba var.epiphylla Mak.）作為銀杏家族的特異種質，特點在

2、于部分胚珠著生在葉片的邊緣，且葉籽銀杏具有穩(wěn)定的可遺傳變異，但目前對于葉籽銀杏的發(fā)生機制尚不可知。開展葉籽銀杏葉生胚珠的發(fā)生和發(fā)育過程中的分子機理和相關的遺傳調控機制的研究具有重要的理論意義。
　　MicroRNA(miRNA)是一類長度為18～25個堿基的非編碼內源小分子RNA，它通過作用靶基因mRNA來調控生物體內基因的表達，方式主要有直接裂解mRNA或抑制靶基因的翻譯。且miRNA調控功能范圍廣泛，在植物器官分化、形態(tài)建成、

3、極性發(fā)育、激素信號轉導、脅迫響應、抗逆性等方面發(fā)揮重要的作用。開展葉籽銀杏miRNA層面的研究，將有助于探明葉生胚珠發(fā)生過程中miRNA介導的基因表達調控模式，為葉籽銀杏葉生胚珠發(fā)生的分子機制提供理論依據(jù)。
　　本研究以葉籽銀杏為研究材料，采用基于Solexa測序平臺的新一代高通量測序技術分別構建發(fā)端期著生葉生胚珠葉片及正常葉片的sRNA文庫，并結合生物信息學方法，鑒定miRNAs的種類及表達豐度情況，篩選出兩樣品間差異miRNA

4、s;并以銀杏轉錄組mRNA文庫組裝的unigene為參考序列，對差異miRNAs靶基因進行預測進而了解葉生胚珠發(fā)生的基因表達調控網(wǎng)絡;采用實時熒光定量PCR技術定量分析葉籽銀杏兩樣品間差異miRNAs及其靶基因的表達情況。本研究的主要結果如下:
　　1.sRNA測序總體情況分析
　　分別構建葉籽銀杏著生葉生胚珠葉片和正常葉片sRNA文庫，Solexa測序技術后分別獲得22，401，208和19，042，060條原始冗余序列，

5、通過去除接頭、低質量等無意義序列后，得到21，876，638條和18，420，986條高質量的純凈序列(clean sequence)，其中特異序列(unique sequence)分別為2，585，993條和2，640，731條。兩文庫中共有冗余序列占總數(shù)的88.49％，其中共有的特異序列占總共特異序列數(shù)量的15.91％。兩個文庫高通量測序長度分布統(tǒng)計表明，兩文庫中長度分布大體趨勢相似，均在21nt和24nt有兩個高峰。21 nt冗余

6、序列所占比例遠遠高于24 nt，在著生葉生胚珠葉片和正常葉片文庫中分別占到65.96％和56.77％。
　　2.葉籽銀杏保守miRNAs
　　將獲得的高質量sRNA序列與來自GenBank和Rfam(9.1)數(shù)據(jù)庫的非編碼RNA進行比對篩選，去除其他非編碼RNA，將候選的sRNA與miRBase20.0比對篩選完美匹配的保守miRNAs。在兩個樣品中共鑒定來自23個家族的82個成員。除miR3522、miR1507、miR1

7、509、miR1314外，絕大部分miRNAs在其他物種中具有高度保守性。不同家族之間及同家族不同成員間的表達豐度變化較大。總體上，保守性越高，成員構成越多的家族表達量越高，如miR168、miR172、miR396、miR156、miR390。反之，保守性較低，家族成員數(shù)較少的家族表達量相對較低。對樣品間保守miRNAs進行差異分析，總計來自16個家族的25條保守miRNAs在樣品間存在顯著性差異，其中16條miRNAs在著生葉生胚珠

8、葉片中上調表達。采用qRT-PCR驗證了15個保守miRNAs的差異表達情況，與高通量測序結果基本一致。
　　3.葉籽銀杏novel miRNAs
　　著生葉生胚珠葉片和正常葉片兩個sRNA文庫中，共預測53條novel miRNAs，其中25個miRNA*s也被檢測到。34條novel miRNAs在兩個文庫中均檢測到，11條僅在著生葉生胚珠葉片中檢測;8條僅在正常葉片特異檢測。Novel miRNAs成熟序列長度范圍在2

9、0-22nt，其中21 nt為主要類型，所占比例達66.04％。同保守miRNAs首位堿基偏好型一致，novel miRNAs首位堿基也以5'端U為主要類型。NovelmiRNAs前體序列長度為67-268 bp，平均長度為126bp，平均前體序列的MFE為-46.0 kcal/mol。Novel miRNAs表達豐度較保守miRNAs低。Novel miRNAs差異分析表明，10條novel miRNAs表達量在著生葉生胚珠葉片中顯著

10、上調;相反，11條表達量下調。不同novel miRNAs之間表達水平差異較大，差異倍數(shù)在2到14之間。采用qRT-PCR技術驗證了隨機挑選的6個novel miRNAs在兩樣品間的表達情況，與高通量測序結果基本一致。
　　4.差異miRNAs靶基因調控
　　對保守及novel miRNAs進行靶基因預測，靶基因多為功能未知蛋白或預測蛋白，還有部分為涉及生長發(fā)育和環(huán)境適應等方面的轉錄因子。對差異miRNAs靶基因進行GO注釋

11、，其中在著生葉生胚珠葉片中上調的38條miRNAs對應靶基因111條unigene序列，而34條下調的miRNAs對應88條unigene序列。著生葉生胚珠葉片中較多的靶基因富集在生物調節(jié)（biological regulation）、發(fā)育過程(developmentprocess)、生殖（reproduction）和信號傳遞（signaling）催化活性(catalyticactivity)等方面。葉籽銀杏葉生胚珠發(fā)生過程中，差異mi

12、RNAs可能通過參與植物激素調節(jié)及調控胚珠發(fā)育相關的基因的表達來發(fā)揮重要的調控作用。采用qRT-PCR對10個靶基因的差異表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)靶基因的表達模式基本與相應的miRNA差異表達情況相反。
　　綜上所述，通過對葉籽銀杏著生葉生胚珠葉片和正常葉片構建sRNA文庫，獲得葉籽銀杏保守及novel miNRAs，預測樣品間差異表達的miRNAs對應的靶基因的功能，并采用熒光定量PCR技術驗證部分miRNAs及其靶基因的表達。miR