葉籽銀杏EFRO發(fā)育過(guò)程中DNA甲基化修飾機(jī)理及系統(tǒng)學(xué)意義.pdf

1、銀杏（Ginkgo biloba L）有許多原始和進(jìn)化特征。銀杏屬實(shí)際上可能是現(xiàn)存的種子植物中最古老的一個(gè)屬。國(guó)內(nèi)外大量研究表明銀杏是比較形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、胚胎發(fā)育及系統(tǒng)發(fā)育研究的最理想的試材之一。
　　 葉籽銀杏（Ginkgo biloba var.epiphylla Mak.）作為銀杏家族中的一個(gè)特異種質(zhì)，具有重要的理論和觀賞價(jià)值。其最大特點(diǎn)在于葉生雌性生殖器官(epiphyllous femalereproductive o

2、rgan,EFRO)的個(gè)體發(fā)生和結(jié)構(gòu)。它們對(duì)銀杏的系統(tǒng)發(fā)育、起源、演化及親緣關(guān)系的研究具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)葉籽銀杏葉生雌性生殖器官(EFRO)發(fā)育與再生過(guò)程中DNA甲基化分子機(jī)制的研究，以期揭示葉籽銀杏雌性生殖器官的形態(tài)學(xué)本質(zhì)及其系統(tǒng)學(xué)意義。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果和主要結(jié)論如下：
　　 本研究采用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)(MSAP)，以葉籽銀杏、銀杏及攀枝花蘇鐵、鐵線(xiàn)蕨兩個(gè)外類(lèi)群為材料，從54 對(duì)MSAP 選擴(kuò)增引物中，選出擴(kuò)增清晰、

3、可辨且可重復(fù)的16-24 對(duì)MSAP引物組合，擴(kuò)增獲得這四個(gè)物種的DNA胞嘧啶甲基化修飾水平及MSAP 擴(kuò)增圖譜，結(jié)果表明葉籽銀杏基因組中至少有48.7％（全甲基化34％、半甲基化14.7％）、銀杏44.0％（全甲基化32.8％、半甲基化11.2％）、蘇鐵39.6％（全甲基化29.2％、半甲基化9.8％）、鐵線(xiàn)蕨44.6％（全甲基化29.4％、半甲基化15.2％）的CCGG/GGCC位點(diǎn)發(fā)生胞嘧啶甲基化。與相關(guān)物種比較，這四個(gè)物種的DN

4、A 胞嘧啶甲基化水平整體較高。植物基因組DNA 胞嘧啶甲基化修飾檢出率不同，反映了在基因組水平上的物種的差異性。
　　 本研究通過(guò)對(duì)葉籽銀杏、銀杏在萌動(dòng)期和展葉期的CCGG/GGCC位點(diǎn)胞嘧啶甲基化進(jìn)行的總體分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)萌動(dòng)期葉籽銀杏甲基化水平47.6％、銀杏42.4％，展葉期葉籽銀杏著生葉生胚珠的葉籽銀杏（YZ）甲基化水平48.3％、沒(méi)有著生葉生胚珠的葉籽銀杏（YC）40.5％、銀杏（CK）41.5％，體現(xiàn)為葉籽銀杏的甲基化

5、高于YC及CK；同時(shí)葉籽銀杏、銀杏在甲基化模式上存在著豐富的差異，萌動(dòng)期葉籽銀杏相對(duì)于銀杏去甲基化比例為13.2％，超甲基化比例為14.6％，超甲基化的比例略高于去甲基化；展葉期YZ 相對(duì)于YC 去甲基化比例為8.2％，超甲基化比例為16.0％，YZ 相對(duì)于CK 去甲基化比例為4.8％，超甲基化比例為28％，總體表現(xiàn)為展葉期的YZ 相對(duì)于YC及CK的超甲基化水平高于萌動(dòng)期的超甲基化水平。顯示萌動(dòng)期與展葉期葉籽銀杏甲基化修飾的水平不同。說(shuō)

6、明葉籽銀杏EFRO 發(fā)育過(guò)程中胞嘧啶甲基化具有時(shí)空特異性。
　　 本研究對(duì)葉籽銀杏不同組織DNA 胞嘧啶甲基化的水平、模式及模式上的差異類(lèi)型進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉籽銀杏不同組織DNA 胞嘧啶甲基化的水平不同，其發(fā)端期47.7％、雌配子發(fā)育前期（前期）46.0％、雌配子發(fā)育中期（中期）45.2％、雌配子發(fā)育后期（后期）41.8％、葉籽銀杏正常胚珠胚乳初期（CK）35.3％。不同組織在甲基化模式上也存在著廣泛的差異，表現(xiàn)為發(fā)端期相應(yīng)于

7、前期去甲基化比例為19.7％、超甲基化比例為14.6％，中期去甲基化比例20.0％、超甲基化比例為13.30％，后期去甲基化比例為20.3％、超甲基化比例為14.6％，CK 去甲基化比例為20.3％，超甲基化比例為18.8％。不同組織甲基化模式上的差異體現(xiàn)為發(fā)端期組織相對(duì)于雌配子發(fā)育的三個(gè)時(shí)期的組織（前期、中期、后期）及葉籽銀杏正常胚珠胚乳初期組織（CK）的去甲基化水平高于超甲基化水平，發(fā)生了去甲基化，這個(gè)時(shí)期有更多的基因表達(dá)，是葉籽銀

8、杏EFRO 形成的關(guān)鍵時(shí)期。葉籽銀杏在不同時(shí)期、不同組織這種去甲基化/超甲基化的變化式樣，對(duì)揭示葉籽銀杏EFRO 形成的可能機(jī)制及系統(tǒng)學(xué)意義奠定了基礎(chǔ)。
　　 本研究從54 對(duì)MSAP 選擴(kuò)引物中，選出16 對(duì)MSAP 選擴(kuò)引物組合，擴(kuò)增產(chǎn)生葉籽銀杏不同單株清晰可辨的MSAP 擴(kuò)增圖譜，檢測(cè)其甲基化水平，發(fā)現(xiàn)不同單株甲基化水平不同，其中，沂源油坊(I 油坊)為47.2％、沂源織女洞南(I 織南)44.09％、沂源織女洞北(I 織

9、北)43.8％、沂源白裕(I 白裕)43.3％、沂源中河(I中河)43.5％、泰安老君堂正常銀杏（CK）39.7％。不同單株在甲基化模式上也存在著廣泛的差異，I 油坊相對(duì)于I 織南、I 織北、CK的去甲基化比例分別為8.7％、13.3％和8.42％，超甲基化比例分別為27.1％、11.22％、13.68％。在同一時(shí)期，I 油坊較之其他幾株表現(xiàn)為較高的超甲基化水平，或許與I 油坊樹(shù)齡大（樹(shù)齡為1300年，其余在700年左右）有關(guān)。即植物形

10、態(tài)的構(gòu)成與年齡有一定的關(guān)聯(lián)。
　　 本研究采用分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)部分葉籽銀杏、銀杏修飾位點(diǎn)及葉籽銀杏多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行克隆和序列分析，通過(guò)匹配的同源序列功能注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)葉籽銀杏、銀杏基因組中包括大量的重復(fù)序列、轉(zhuǎn)座子序列、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列、F-boX蛋白、葉綠體通道蛋白、鈉離子通道蛋白、泛素蛋白、假設(shè)蛋白及乙酸脫氫酶在內(nèi)的多種類(lèi)型DNA序列中均存在DNA甲基化修飾現(xiàn)象。這些基因在葉籽銀杏和銀杏中的甲基化狀態(tài)被修飾的程度不