弓形蟲入侵轉(zhuǎn)化過程中宿主Rac1及蟲體DNA甲基化的作用研究.pdf

1、弓形蟲是一種機(jī)會性致病原蟲，人和其他溫血動物均可通過多種途徑被感染。弓形蟲入侵宿主細(xì)胞的過程主要包括粘附細(xì)胞膜，納蟲泡(PV)的形成等。中間宿主感染后，弓形蟲可實(shí)現(xiàn)速殖子向緩殖子的轉(zhuǎn)化，形成慢性感染;當(dāng)宿主免疫力低下時(shí)，緩殖子則會向速殖子轉(zhuǎn)化，引起急性發(fā)病。目前關(guān)于弓形蟲入侵及速、緩殖子相互轉(zhuǎn)化機(jī)制尚不完全清楚。
　　目的:宿主Rac1在細(xì)胞骨架重組中扮演著重要的角色，以往研究發(fā)現(xiàn)弓形蟲入侵宿主細(xì)胞過程中Rac1在納蟲泡膜(PVM

2、)上存在聚集現(xiàn)象。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式，主要參與物種表型的可塑性和適應(yīng)性。本研究著重探討弓形蟲入侵轉(zhuǎn)化過程中宿主Rac1及蟲體DNA甲基化的作用。
　　方法:Rac1抑制劑(NSC23766)處理HFF細(xì)胞后用RH-GHP-SAG1株弓形蟲感染細(xì)胞，觀察統(tǒng)計(jì)弓形蟲入侵效率。抑制劑處理細(xì)胞后觀察宿主actin在弓形蟲感染時(shí)的重排現(xiàn)象。宿主Rac1與弓形蟲ROP2共定位現(xiàn)象觀察。COS-7細(xì)胞中過表達(dá)CFP-Rac

3、1-WT后感染弓形蟲，在不同的時(shí)間點(diǎn)統(tǒng)計(jì)Rac1陽性PVs。Western blot檢測弓形蟲感染后不同時(shí)間點(diǎn)Rac1磷酸化水平變化。NSC23766處理細(xì)胞后觀察抑制劑對弓形蟲增殖的影響。
　　檢測核蛋白DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)活性。體外克隆表達(dá)弓形蟲DNMT基因Tgdnmta和Tgdnmtb，純化重組表達(dá)的TgDNMTa和TgDNMTb并進(jìn)行DNMT活性檢測。qPCR檢測兩個(gè)基因在速、緩殖子的表達(dá)水平。弓形蟲速、緩殖子全基

4、因組DNA甲基化高通量亞硫酸氫鹽測序。特定位點(diǎn)測序結(jié)果驗(yàn)證。差異甲基化基因的生物信息學(xué)分析。DNMT抑制劑(5-AzaC)處理弓形蟲后，觀察5-AzaC對其入侵增殖的影響。構(gòu)建弓形蟲DNMTs敲除蟲株。
　　結(jié)果:NSC23766處理細(xì)胞后弓形蟲的入侵效率顯著低于正常組(p＜0.05)。正常細(xì)胞感染弓形蟲時(shí)細(xì)胞骨架重組更活躍。宿主Rac1與弓形蟲ROP2在PVM上共定位。弓形蟲一旦開始入侵便會招募Rac1向PVM聚集，隨著入侵時(shí)間

5、的延長，Rac1會從PVM上消失。宿主細(xì)胞Rac1磷酸化水平隨著弓形蟲感染時(shí)間的增加（0-6小時(shí)）而增強(qiáng)。長期用NSC23766處理細(xì)胞會抑制弓形蟲在PV增殖(p＜0.05)。
　　弓形蟲存在兩個(gè)DNMT蛋白:TgDNMTa和TgDNMTb。重組表達(dá)的TgDNMTa和TgDNMTb蛋白均具有DNMT活性，兩個(gè)基因在緩殖子轉(zhuǎn)錄水平均高于速殖子。緩殖子甲基化位點(diǎn)多于速殖子。速、緩殖子存在差異DNA甲基化的基因主要參與一些基礎(chǔ)的能量代謝