DNA異常甲基化在氡與香煙煙霧致BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用.pdf

1、目的：
　　通過(guò)體外單獨(dú)染氡、香煙及聯(lián)合染毒誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，建立惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中甲基化轉(zhuǎn)移酶基因 mRNA表達(dá)以及全基因組甲基化水平的改變，以及利用高通量甲基化芯片篩選單獨(dú)及聯(lián)合染毒發(fā)生DNA啟動(dòng)子區(qū)域異常甲基化的特異基因，探索氡、香煙聯(lián)合致肺癌的機(jī)制，為氡、香煙聯(lián)合致肺癌的防治提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEAS-2B細(xì)胞以1.5×105個(gè)接種于0

2、.4μm Transwell膜中，細(xì)胞貼壁后將Transwell膜置于染毒腔內(nèi)，毒氣持續(xù)泵入在膜上方直接與細(xì)胞接觸染毒，氧氣濃度恒定于21％，水浴維持染毒腔溫度在37℃，每次同時(shí)染毒3個(gè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組 C、氡氣染毒組 Rn、香煙煙霧染毒組 Sm和聯(lián)合染毒組 RS。使用 CCK-8試劑盒檢測(cè)不同氡、香煙染毒濃度后細(xì)胞存活率，確定合適的單獨(dú)及聯(lián)合染毒劑量。染氡兩次后將Transwell膜中細(xì)胞消化，置于培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)，待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后

3、進(jìn)行下一代染氡，共染毒15代。對(duì)照組暴露于濃度為空氣本底值的相同裝置中，其余條件同染毒組。完成15代染毒并傳代至20代后，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期、凋亡變化，軟瓊脂分析克隆形成，酶標(biāo)儀檢測(cè)全基因組甲基化水平，熒光定量 PCR檢測(cè)DNMT1、DNMT3A和DNMT3B基因mRNA表達(dá)情況。Illumina450k甲基化芯片篩選單獨(dú)及聯(lián)合染毒發(fā)生異常甲基化的特異基因，并檢測(cè) SPDEF、CDK5RAP1、PTPRM和ABCG1基因mRNA表達(dá)

4、情況。
　　結(jié)果：
　　（1）細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的建立。在染毒時(shí)間相同條件下，隨染毒劑量升高，細(xì)胞存活率逐漸下降；氡、煙聯(lián)合染毒CI值＜1，提示二者具有協(xié)同效應(yīng)；確定氡染毒濃度和時(shí)間為20000Bq/m3，30min；香煙煙霧染毒濃度和時(shí)間分別為20%，10min。細(xì)胞周期顯示染毒15代傳代20代的細(xì)胞G1期明顯縮短，S期明顯延長(zhǎng)，聯(lián)合染毒組細(xì)胞S期延長(zhǎng)最為明顯，表明細(xì)胞處于增殖旺盛狀態(tài)，其周期發(fā)生一定程度的失控，同時(shí)細(xì)胞凋亡

5、率明顯降低，呈現(xiàn)凋亡抑制狀態(tài)。與對(duì)照組相比，染毒15代傳代20代細(xì)胞軟瓊脂克隆形成能力已明顯形成，聯(lián)合染毒組細(xì)胞軟瓊脂克隆形成率已達(dá)到24.00±0.31（P<0.05）。（2）全基因組甲基化水平及甲基化水平的改變：與對(duì)照組相比，單獨(dú)及聯(lián)合染毒組全基因組甲基化水平呈下降趨勢(shì)，染毒15代傳代20代細(xì)胞甲基化水平降至最低；染毒組細(xì)胞DNMT1基因表達(dá)明顯降低，DNMT3A,DNMT3B基因表達(dá)明顯升高，表明染毒后BEAS-2B細(xì)胞在發(fā)生了全

6、基因組低甲基化的同時(shí)伴有部分CPG島的高甲基化。（3）甲基化芯片篩選氡、煙單獨(dú)及聯(lián)合染毒特異性基因：利用Illumina450k甲基化芯片對(duì)Rn15-20,Rs15-20,Sm15-20進(jìn)行檢測(cè)，篩選出SPDEF，CDK5RAP1，PTPRM，ABCG1基因。聯(lián)合染毒組異常甲基化基因 CDK5RAP1，在細(xì)胞的周期與凋亡調(diào)控中占據(jù)重要地位；單獨(dú)染氡組異常甲基化基因ABCG1，負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)膽固醇的動(dòng)態(tài)平衡；單獨(dú)染煙組異常甲基化基因PTP

7、RM，參與內(nèi)皮細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)節(jié)，內(nèi)皮細(xì)胞遷移的負(fù)調(diào)控；氡、煙單獨(dú)染毒組交集基因 SPDEF,介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化和惡性變。對(duì)篩選基因 mRNA表達(dá)情況進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)與分析，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，聯(lián)合染毒組 CDK5RAP1 mRNA表達(dá)降低明顯；單獨(dú)染毒組SPDEF mRNA表達(dá)升高明顯；氡染毒組 ABCG1 mRNA表達(dá)升高明顯；煙染毒組PTPRM mRNA表達(dá)降低明顯（P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.建立了體外染氡、煙聯(lián)合