香煙煙霧與氡對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的損傷效應(yīng).pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)以香煙煙霧與氡單獨(dú)和聯(lián)合對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B細(xì)胞)體外染毒，探討香煙煙霧與氡對(duì)BEAS-2B細(xì)胞活性氧(Reactive oxygenspecies，ROS)、8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG)、細(xì)胞周期與凋亡、惡性轉(zhuǎn)化及基因mRNA表達(dá)的異同，并初步探討兩者單獨(dú)和聯(lián)合作用的形式和機(jī)制，為進(jìn)一步研究吸煙和氡致肺癌提供理論依據(jù)。 方法：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEAS-

2、2B細(xì)胞以每孔1×105/ml的密度接種于transwell培養(yǎng)皿中，每孔1.5ml。細(xì)胞貼壁后將transwell培養(yǎng)皿置于細(xì)胞氣體染毒裝置中染毒，培養(yǎng)基霧化保持細(xì)胞濕潤(rùn)，氧氣濃度21％，流量10ml/min。以細(xì)胞增殖抑制率判斷模型合適的染毒時(shí)間和濃度。確定好合適的染毒時(shí)間及濃度后，將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組(C組)、單獨(dú)煙霧染毒組(Sm組)、單獨(dú)氡染毒組(Rn組)、先染煙后染氡組(Sm+Rn組)和先染氡后染煙組(Rn+Sm組)。Sm組煙

3、霧濃度為20％，每次染煙10min；Rn組氡濃度為20000Bq/m3，每次染氡20min，Sm+Rn組先染煙10min然后染氡20min； Rn+Sm組先染氡20min然后染煙10min；其中聯(lián)合染毒組香煙煙霧與氡的濃度同Sm組和Rn組。各染毒組每周染毒兩次后傳代，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后繼續(xù)染毒。對(duì)照組暴露于無(wú)菌空氣中，其余條件同染毒組。染毒后：(1)CCK-8法檢測(cè)染毒第1代細(xì)胞增殖抑制率。(2)激光共聚焦顯微鏡熒光探針技術(shù)檢測(cè)染

4、毒第1代和第5代細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的平均含量。(3)8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)染毒第1代和第5代8-OHdG含量。(4)流式細(xì)胞儀分析染毒第1代和第5代細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況。(5)染毒第5代細(xì)胞停止染毒，常規(guī)傳代至第5代，以細(xì)胞倍增時(shí)間、血清抗性實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化情況。采用RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞FHIT基因、突變型p53基因、p16基因mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果：(1)染煙和氡的

5、細(xì)胞模型建立分析結(jié)果顯示：染毒時(shí)間相同，染毒濃度越高，細(xì)胞增殖抑制率越高；染毒濃度相同，染毒時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率越高。(2)染毒對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS和8-OHdG含量的影響：與對(duì)照組細(xì)胞相比，染毒第1代和第5代染毒組細(xì)胞內(nèi)ROS含量和8-OHdG含量均顯著升高；與單純?nèi)径窘M相比，染毒第1代和第5代聯(lián)合染毒組細(xì)胞內(nèi)ROS含量和8-OHdG含量均顯著升高，表明聯(lián)合染煙與染氡對(duì)細(xì)胞內(nèi)8-OHdG的產(chǎn)生有協(xié)同作用。染毒第5代各組與染毒第1代對(duì)應(yīng)組

6、相比，8-OHdG含量顯著升高。(3)細(xì)胞周期與凋亡分析結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，染毒第1代各組G2/M期細(xì)胞百分比均顯著減少；與對(duì)照組相比，染毒第1代和第5代組細(xì)胞凋亡率均顯著升高；染毒第1代聯(lián)合染毒組細(xì)胞凋亡率與單獨(dú)染毒組相比升高。染毒第5代各組細(xì)胞G2/M期百分比與染毒第1代對(duì)應(yīng)組相比均顯著增多，而細(xì)胞凋亡率均顯著下降。(4)惡性轉(zhuǎn)化結(jié)果顯示：與對(duì)照組和單獨(dú)染毒組相比，聯(lián)合染毒組細(xì)胞血清克隆形成率和軟瓊脂克隆形成率顯著增高，倍增時(shí)間

7、顯著縮短。(5)各組基因mRNA表達(dá)結(jié)果顯示：與對(duì)照組細(xì)胞相比，Rn+Sm組細(xì)胞p16基因和FHIT基因mRNA表達(dá)顯著降低；突變型p53基因mRNA表達(dá)顯著升高。 結(jié)論：(1)建立了體外染煙和染氡的細(xì)胞模型。(2)體外染煙和染氡可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的DNA氧化損傷作用，使細(xì)胞凋亡率上升，聯(lián)合染煙與染氡對(duì)細(xì)胞的氧化損傷和惡性轉(zhuǎn)化程度影響有協(xié)同作用。(3)先染氡后染煙可使細(xì)胞p16基因和FHIT基因mRNA表達(dá)降低，突變型p53基因m