基于BEAS-2B細胞模型的青翹提取物抗炎活性研究.pdf

1、連翹為木犀科植物連翹Forsythia Suspensa(Thunb.) Vahl的干燥果實，是中醫(yī)常用傳統(tǒng)中藥。藥典收錄含有連翹的中藥處方有40多種，如雙黃連口服液、銀翹解毒片和芩連片等。中藥連翹具有清熱解毒、消腫散結之功效，用于潰瘍、感染等疾病的治療，如呼吸道感染和丹毒?，F(xiàn)代藥理實驗表明，連翹具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、抗肝損傷等功效。連翹酯苷A（FTA）作為連翹的主要有效成分之一，具有抗菌、抗病毒、解熱鎮(zhèn)痛、抗氧化及免疫調節(jié)作

2、用。根據(jù)中醫(yī)用藥習慣，連翹針對人“上焦”肺系統(tǒng)等疾病的治療有較好的效果，而呼吸道上皮是病原體入侵呼吸系統(tǒng)的首要組織防線，在先天免疫系統(tǒng)中具有重要的作用。炎癥發(fā)生時，呼吸道上皮細胞能夠產生細胞因子、趨化因子及抗菌肽等免疫因子參與炎性反應。為了闡明連翹對“上焦”呼吸系統(tǒng)疾病治療效果較好的用藥特點，本文以人呼吸道上皮細胞（BEAS-2B）為模型載體，研究連翹提取物的抗炎活性及其作用機制。另外，本文還比較了不同產地連翹提取物的抗氧化活性及其對

3、BEAS-2B細胞損傷的保護作用。
　　1.不同產地青翹提取物的體外抗氧化活性研究
　　采用清除DPPH·自由基的方法，對21個不同產地的連翹藥材的40％乙醇提取物進行體外抗氧化研究，結果表明連翹提取物均表現(xiàn)出良好的體外抗氧化活性，通過對其清除DPPH·自由基IC50的測定，能顯示不同產地之間的差異，通過判別分析對21個產地提取物的抗氧化活性進行有效區(qū)分。
　　2.不同產地青翹提取物對BEAS-2B細胞損傷的保護作用<

4、br>　　以金黃色葡萄球菌（過濾液或滅活的菌體）為致炎物建立 BEAS-2B細胞損傷模型，考察21個產地青翹提取物對BEAS-2B細胞損傷的保護作用。實驗分3大組，分別為Control組、Model組、給藥組（安澤等21個產地連翹藥材40%乙醇提取物）。Control組：細胞常規(guī)培養(yǎng)；Model組：400μg/mL（濕重）金黃色葡萄球菌致炎物作用細胞24 h；給藥組：50μg/mL連翹提取物預處理BEAS-2B細胞2 h后，再給予400

5、μg/mL（濕重）金黃色葡萄球菌致炎物作用24 h。結果顯示，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Control組細胞生長狀態(tài)良好，Model組局部細胞邊緣模糊，細胞觸角減少，有變圓的傾向，給藥組能在一定程度上改善這種狀態(tài)；MTT法檢測各組細胞存活率發(fā)現(xiàn)，Model組與 Control組存在明顯差異，給藥組能對金黃色葡萄球菌致炎物導致BEAS-2B細胞的損傷起到預防作用。
　　3.青翹提取物對BEAS-2B細胞模型的抗炎機制研究
　　用LPS

6、誘導BEAS-2B細胞產生炎癥，設置不同濃度的青翹提取物對BEAS-2B細胞給予預防治療，通過檢測細胞因子及炎癥介質的分泌情況，考察FSE的抗炎效果；通過對IKK-α、p65的磷酸化程度檢測，可顯示NF-κB信號通路被活化的情況，進而揭示FSE可能的抗炎機制。實驗共分13組，分別為Control組、Model組（LPS，1μg/mL）、陽性藥組（吲哚美辛、地塞米松，1μM）、90%FTA組（25、50、100μg/mL）、60%FTA組

7、（25、50、100μg/mL）、FSEE組（25、50、100μg/mL）。
　　試驗結果表明：①鏡檢法觀察細胞形態(tài)變化，Model組與 Control組無明顯差異；②采用試劑盒檢測細胞上清中的NO與細胞內的ROS、SOD水平。其中，1μg/mL LPS刺激BEAS-2B細胞24 h后，模型組NO、ROS釋放量顯著增加；FSE給藥組均表現(xiàn)出較強的降低NO、ROS含量的作用，90%FTA、60%FTA、FSEE組隨著濃度的增加，降

8、低細胞內NO、ROS含量的效果越明顯，有劑量依賴關系。另外，模型組SOD含量顯著降低，90%FTA、60%FTA組在25、50μg/mL時有預防作用，F(xiàn)SEE組在50μg/mL時有預防作用，其中以90% FTA高濃度時預防BEAS-2B細胞損傷的作用最好；③ELISA法檢測細胞上清中IL-6的水平。LPS刺激24 h后，細胞上清中IL-6含量顯著增加，F(xiàn)SEE、60%FTA、90%FTA組在25、50、100μg/mL均能抑制LPS誘導

9、的IL-6產生，其中以90%FTA的效果最好；④Q-RT-PCR方法檢測細胞中IL-6、IL-8、TNF-αmRNA的表達。1μg/mL LPS刺激BEAS-2B細胞24 h后，模型組IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA的表達量顯著增加；陽性對照組（地塞米松）IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA的表達量明顯減少；90%FTA組在25、50、100μg/mL均表現(xiàn)出良好的抑制IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA表達的效果；60

10、%FTA組與FSEE組在25、50、100μg/mL能抑制IL-6、IL-8 mRNA的表達，但不能抑制TNF-αmRNA的表達。⑤Western Blot法檢測細胞中IKK-α、P65蛋白及其磷酸化水平的表達。正常對照組中IKK-α、p65的磷酸化程度很低，加入LPS（1μg/mL）刺激后可以導致IKK-α、p65的磷酸化程度明顯升高，這說明NF-κB信號通路被高度活化。通過比較p-IKK/IKKα、p-p65/p65，90%FTA、

11、60%FTA、FSEE三種FSE提取物可以不同程度的抑制NF-κB信號通路的活化，其中以90%FTA的效果較顯著，Dex與FSEE組效果不顯著。本實驗證實了90%FTA提取物具有更好的抗內毒素作用，其機制可能與其干擾 LPS-TLR4-MyD88-NF-κB信號通路有關。
　　通過上述研究發(fā)現(xiàn)，連翹提取物能提高金黃色葡萄球菌致炎物作用的BEAS-2B細胞的生存率，并能抑制LPS誘導的BEAS-2B細胞分泌的炎性因子IL-6、IL-