2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、背景:煤焦瀝青(CTP)是最早被發(fā)現(xiàn)的化學(xué)致癌物之一,它與職業(yè)性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),但其誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。本文主要通過(guò)研究煤焦瀝青煙提取物誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中染色體變化,探討染色體不穩(wěn)定性(CIN)在癌變過(guò)程中的作用。
   染色體不穩(wěn)定性是指細(xì)胞在有絲分裂過(guò)程中喪失和(或)獲得整條染色體或染色體片段頻率的升高。絕大多數(shù)腫瘤表現(xiàn)為染色體不穩(wěn)定性,是惡性細(xì)胞最顯著的特征之一。
   染色體不穩(wěn)定性

2、主要表現(xiàn)為數(shù)目和結(jié)構(gòu)改變。染色體數(shù)目的改變,又叫非整倍體,是指整條染色體的獲得或丟失;染色體結(jié)構(gòu)的改變包括染色體的缺失、擴(kuò)增、倒位、易位、環(huán)狀染色體、雙著絲粒染色體等改變。
   染色體不穩(wěn)定性的發(fā)生牽涉到細(xì)胞周期的各個(gè)環(huán)節(jié)。主要分為有絲分裂過(guò)程中姊妹染色單體分離異常、中心體異常、紡錘體檢測(cè)點(diǎn)功能缺陷以及端粒異常等4大方面。
   1.姊妹染色單體分離及凝聚異常:DNA復(fù)制后,黏連素將2條染色單體包繞在環(huán)中保證姊妹染色單

3、體配對(duì)。當(dāng)Sccl亞基被分離酶(Separase)切開后,染色單體就會(huì)很容易被釋放出來(lái)。在細(xì)胞周期的大部分時(shí)間內(nèi),分離酶與保全素(Securin)結(jié)合而其水解酶活性被抑制。在細(xì)胞周期中期到后期進(jìn)行中,保全素被降解,釋放分離酶,降解黏連素,使姊妹染色單體分離。
   2.紡錘體檢測(cè)點(diǎn)功能減弱:如果Mad或Bub基因突變或表達(dá)降低,細(xì)胞會(huì)忽略紡錘體的損傷而繼續(xù)分裂,從而形成異常核型。當(dāng)檢測(cè)到有未正確連接的動(dòng)粒時(shí),檢測(cè)點(diǎn)相關(guān)蛋白Mad

4、2被激活從而抑制后期促進(jìn)復(fù)合物APC/C的活性,使保全素不能被水解,從而使姊妹單體不能分離。存腫瘤細(xì)胞中,紡錘體檢測(cè)點(diǎn)功能較其正常組織明顯減弱,并伴隨高頻率CIN。
   3.中心體異常:中心體異常與非整倍體和CIN呈正相關(guān),并在實(shí)體腫瘤中普遍存在。中心體過(guò)表達(dá)存肺痛中很常見,并伴有明顯不典型的形態(tài)、大小和數(shù)量異常。中心體的復(fù)制過(guò)程受到嚴(yán)格地調(diào)控。CDK2/CyclinE復(fù)合物在中心體復(fù)制的調(diào)控中起非常重要的作用。P53可以依賴

5、P53/P21通路抑制CDK2/CyclinE的活性米調(diào)控中心體復(fù)制,P53失活或表達(dá)量降低和CyclinE頻繁地過(guò)度表達(dá),將會(huì)導(dǎo)致中心體擴(kuò)增。P53與染色體不穩(wěn)定/中心體擴(kuò)增間存在正相關(guān)的關(guān)系。中心體異常導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定,對(duì)腫瘤的發(fā)生產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。
   4.端粒、端粒酶異常:絕大部分腫瘤細(xì)胞的端??s短,端粒酶活性升高,以維持細(xì)胞的永生化。端??s短到一定程度將引起端粒末端的融合,引起“橋接-融合-斷裂”循環(huán)導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定,

6、最終演化為腫瘤細(xì)胞的核型,產(chǎn)生癌變。TRF1主要負(fù)責(zé)負(fù)性調(diào)節(jié)端粒的長(zhǎng)度,控制端粒的延伸。TRF2主要負(fù)責(zé)保護(hù)染色體的末端。TRF2丟失將會(huì)導(dǎo)致染色體末端失去保護(hù),造成端粒3’端丟失和染色體末端-末端融合。POT1的作用主要是保護(hù)端粒末端單鏈DNA并與調(diào)控端粒酶的活性有關(guān)。
   核型分析表明,幾乎所有的肺癌都表現(xiàn)出復(fù)雜的核型,大約發(fā)70%~80%的肺癌具有三倍體、四倍體核型,并伴有染色體易位、缺失和異染色質(zhì)等多種結(jié)構(gòu)的變異。染色

7、體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的改變均可引起染色體基因成分的改變。
   腫瘤細(xì)胞普遍存在的染色體不穩(wěn)定性在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、演化過(guò)程中起到何種作用,目前尚有爭(zhēng)論。
   本研究利用中溫煤焦瀝青煙提取物作為誘導(dǎo)劑,建立永生化人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B的惡性轉(zhuǎn)化模型,在確定細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的前提下,觀察細(xì)胞整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程中不同時(shí)期染色體改變與細(xì)胞轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系,并對(duì)其可能的機(jī)制從姊妹染色單體分離及凝聚異常、紡錘體檢測(cè)點(diǎn)功能的減弱、中心體異

8、常和端粒、端粒酶異常等4個(gè)方面加以分析,以探討煤焦瀝青的致肺癌機(jī)制,為預(yù)防煤焦瀝青接觸者罹患職業(yè)性肺部腫瘤提供理論依據(jù)。
   研究目的:分析煤焦瀝青豐成分,建立人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B的惡性轉(zhuǎn)化模型;觀察不同時(shí)期細(xì)胞的染色體不穩(wěn)定性與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系;
   從姊妹染色單體分離及凝聚異常、紡錘體檢測(cè)點(diǎn)功能的減弱、中心體異常和端粒、端粒酶異常等4個(gè)方面分析染色體不穩(wěn)性的機(jī)制,探討煤焦瀝青的致肺癌機(jī)制,為預(yù)防煤

9、焦瀝青接觸者罹患職業(yè)性肺部腫瘤提供理論依據(jù)。
   材料和方法:
   1、實(shí)驗(yàn)材料:中溫煤焦瀝青:從安陽(yáng)鋼鐵公司焦化廠獲得,碾碎成10μm~20μm的微細(xì)粉,溫度控制在400℃左有,任其產(chǎn)生煙霧,用粉塵采樣器收集煙塵,二氯甲烷提取,DMSO溶解后常溫保存?zhèn)溆谩?br>   細(xì)胞株:永生化人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B細(xì)胞株。
   裸鼠:BALB/C裸鼠24只,雌性,SPF級(jí),5-6周齡,體重10-20g,購(gòu)

10、白湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。
   2、方法
   2.1煤焦瀝青煙提取物成分分析和對(duì)BEAS-2B細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn):取煤焦瀝青DMSO溶液,用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析鑒定。通過(guò)NIST質(zhì)譜庫(kù)自動(dòng)檢索獲得各成分鑒定結(jié)果,按照峰面積歸一法進(jìn)行相對(duì)定量分析。用MTT法檢測(cè)煤焦瀝青煙提取物對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn),并計(jì)算LC50。
   2.2煤焦瀝青煙提取物誘導(dǎo)BEAS-2B惡性轉(zhuǎn)化和染色體不穩(wěn)定性觀察:

11、以2.0 mg/L煤焦瀝青煙提取物誘導(dǎo)并觀察BEAS-2B細(xì)胞傳代轉(zhuǎn)化過(guò)程中的形態(tài)學(xué)改變;檢測(cè)細(xì)胞的錨著獨(dú)立性生長(zhǎng)能力并用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證,用傳統(tǒng)核型分析方法觀察細(xì)胞染色體的動(dòng)態(tài)變化。細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變時(shí),用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖周期變化并用M-FISH法觀察細(xì)胞的染色體細(xì)微結(jié)構(gòu)改變。煤焦瀝青對(duì)細(xì)胞DNA損傷作用的檢測(cè):用誘導(dǎo)劑量(2.0 mg/L),對(duì)細(xì)胞染毒24 h,單細(xì)胞凝膠電泳觀察煤焦瀝青煙提取物對(duì)BEAS-2B細(xì)胞造成的D

12、NA損傷作用。
   2.3煤焦瀝青煙提取物致BEAS-2B細(xì)胞染色體不穩(wěn)定性機(jī)制分析:對(duì)誘導(dǎo)后第10、20和30代細(xì)胞均用間接熒光免疫法檢測(cè)中心體的改變,用熒光定量PCR法檢測(cè)端粒長(zhǎng)度改變,熒光定量TRAP法檢測(cè)細(xì)胞的端粒酶活性。用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)各組相關(guān)基岡的mRNA表達(dá)水平;采用細(xì)胞爬片免疫組化的方法半定量檢測(cè)相關(guān)基因的蛋白表達(dá)改變。
   3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS12.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,對(duì)符合正

13、態(tài)分布的數(shù)據(jù),以x±s表示。多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法,以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)(雙側(cè))。
   結(jié)果:
   1.煤焦瀝青煙提取物成分分析和對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的急性毒性實(shí)驗(yàn)
   1.1成分分析:煤焦瀝青煙提取物中總計(jì)鑒定出的38種化合物,主要為多環(huán)芳烴類,占已鑒定成分的87.91%,其余主要為單環(huán)芳烴類、雜環(huán)類和烯烴類化合物。
   1.2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn):煤焦瀝青煙提取物對(duì)于

14、BEAS-2B細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用隨著劑景的加大而逐漸增強(qiáng),呈對(duì)稱S型曲線,LC50為8.64mg/L。
   2.煤焦瀝青煙提取物致BEAS-2B細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和染色體不穩(wěn)定性作用:以LC50的20%左有的劑量作為誘導(dǎo)劑量(2.0 mg/L)誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,經(jīng)過(guò)30代傳代培養(yǎng),細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。
   2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:第10代時(shí),細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變:第20代,誘導(dǎo)組部分細(xì)胞形態(tài)異常,生長(zhǎng)代謝旺盛;第30代,誘導(dǎo)組細(xì)胞

15、排列雜亂無(wú)規(guī)則,大小差異顯著,細(xì)胞生長(zhǎng)失去接觸抑制,出現(xiàn)復(fù)層生長(zhǎng)現(xiàn)象,可見異形核及病理性核分裂相。
   2.2細(xì)胞周期改變:染毒組細(xì)胞傳代至30代,流式細(xì)胞儀測(cè)定其細(xì)胞周期顯示G1期細(xì)胞比例明顯減少,G2/M期細(xì)胞比例明顯增加,表明細(xì)胞正處于增殖旺盛狀態(tài),其周期較對(duì)照組已呈不同程度的生長(zhǎng)加速現(xiàn)象。
   2.3軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn):第10代細(xì)胞煤焦瀝青組有克隆形成,形成率極低(0.4‰)。而第20代誘導(dǎo)組細(xì)

16、胞克隆形成率升高,為5.93‰,高于其他兩組,并且可看到明顯的克隆集落;第30代時(shí),煤焦瀝青組細(xì)胞即能在軟瓊脂上形成陽(yáng)性克隆,細(xì)胞克隆形成率為21.50‰,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常對(duì)照組和DMSO組。形態(tài)學(xué)上,煤焦瀝青組形成的克隆生長(zhǎng)紊亂,無(wú)接觸抑制,可見重疊生長(zhǎng)。煤焦瀝青誘導(dǎo)30代細(xì)胞組接種裸鼠38d后,移植瘤的體積和重量均明顯人于其它3組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。瘤體HE染色結(jié)果顯示,煤焦瀝青誘導(dǎo)的第30代細(xì)胞在裸鼠體形成的腫瘤,組織結(jié)構(gòu)紊亂,核異形

17、明顯并可以發(fā)現(xiàn)小血管形成。說(shuō)明30代細(xì)胞已經(jīng)惡性轉(zhuǎn)化。
   2.4染色體不穩(wěn)定性的觀察:煤焦瀝青誘導(dǎo)組第10代細(xì)胞二倍體核型的比例明顯下降,非整倍體細(xì)胞的比例明顯增加,尤其是亞二倍體和超二倍體的比例升高較多,采用列聯(lián)表x2檢驗(yàn)分析,3組間細(xì)胞染色體數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。X2分割后分析,煤焦瀝青組與正常對(duì)照組和DMSO組間染色體數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但正常對(duì)照組與DMSO組問(wèn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。煤焦瀝青組第20代細(xì)胞二倍體核型

18、比例進(jìn)一步減少(17%),亞二倍體(19%)、超二倍體(62%)所占的比例進(jìn)一步增高。煤焦瀝青誘導(dǎo)組第30代細(xì)胞染色體二倍體核型比例更少(7%),出現(xiàn)了大量非整倍體細(xì)胞,其中包括亞二倍體(15%)和超二倍體(78%)。
   M-FISH結(jié)果表明BEAS-2B細(xì)胞本身已經(jīng)處于不穩(wěn)定的核型,其染色體數(shù)目雖然以近二倍體為主,但是其染色體結(jié)構(gòu)中有人量的交叉互換。煤焦瀝青誘導(dǎo)組BEAS-2B細(xì)胞核型極不穩(wěn)定,出現(xiàn)大量的多倍體核型和亞2倍

19、體核型,染色體有大量的移位,交叉互換和缺失,每個(gè)細(xì)胞核型的細(xì)微結(jié)構(gòu)都有差異。
   2.5煤焦瀝青煙提取物對(duì)BEAS-28細(xì)胞的DNA損傷作用:用誘導(dǎo)劑量(2.0mg/l),對(duì)細(xì)胞染毒24h,單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果顯示,煤焦瀝青組尾長(zhǎng),尾距,彗星長(zhǎng)和Olive尾矩均顯著增加,與空白對(duì)照組和DMSO組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明煤焦瀝青可以直接作用于BEAS-2B細(xì)胞引起DNA損傷,產(chǎn)生遺傳毒性。
   3、煤焦瀝青煙提取物致BE

20、AS-2B細(xì)胞染色體不穩(wěn)定性機(jī)制研究
   3.1煤焦瀝青煙提取物對(duì)BEAS-2B細(xì)胞姊妹染色單體分離及凝聚相關(guān)基因的影響:誘導(dǎo)組第30代細(xì)胞中,SMC1基因mRNA表達(dá)水平3組間比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;SMC3和分離酶的基因mRNA表達(dá)水平明顯升高,保全素的基因mRNA表達(dá)水平明顯降低,與其它兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而其它兩組問(wèn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
   免疫組化結(jié)果顯示,誘導(dǎo)組第30代細(xì)胞中,SMC1的表達(dá)水平?jīng)]

21、有改變,而SMC3和分離酶的蛋白表達(dá)水平升高,保全素蛋白表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而其它兩組問(wèn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
   3.2煤焦瀝青煙提取物對(duì)BEAS-2B細(xì)胞紡錘體檢測(cè)點(diǎn)相關(guān)蛋白的影響:與正常對(duì)照組和DMSO組相比較,誘導(dǎo)組第30代細(xì)胞Mad2,Bub1、APC基因mRNA的表達(dá)均降低。誘導(dǎo)組第30代細(xì)胞Mad2、Bub1和APC基因的蛋白表達(dá)都有所降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常對(duì)照組和DMSO組之間3種基因的mR

22、NA和蛋白表達(dá)水甲均沒有明顯改變,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
   3.3煤焦瀝青煙提取物對(duì)BEAS-2B細(xì)胞中心體的影響
   3.3.1中心體的改變:煤焦瀝青誘導(dǎo)后第10代細(xì)胞中心體存在數(shù)目和形態(tài)異常,總異常率為2.79%,高于其它兩組。但3組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第20代細(xì)胞中心體總異常率為6.56%,主要表現(xiàn)為中心體數(shù)目異常(3.41%),明顯高于正常對(duì)照組和DMSO組,而其它兩組間的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第30代細(xì)胞

23、中心體總異常比例明顯增大(22.39%),表現(xiàn)有3種類型,包括數(shù)目異常(12.70%)、形態(tài)異常(5.69%)、數(shù)目及形狀異常(4.00%),與其余兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
   3.3.2 P53、P21和CyclinE mRNA水平的改變:誘導(dǎo)組第10代細(xì)胞中P53、P21和CyclinE mRNA的變化與其它兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而誘導(dǎo)組第20代和第30代細(xì)胞中P53、P21mRNA表達(dá)量均低于其它兩組,而Cycl

24、inE mRNA表達(dá)量高于其它兩組。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
   3.3.3 P53、P21和CyclinE蛋白水平的改變:誘導(dǎo)組第10代細(xì)胞中P53、P21和CyclinE蛋白表達(dá)水平與其它兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而誘導(dǎo)組第20代和第30代細(xì)胞中P53、P21蛋白表達(dá)水平均降低,CyclinE蛋白表達(dá)水平降低高于其它兩組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
   3.4煤焦瀝青煙提取物對(duì)BEAS-2B細(xì)胞端粒、端粒酶的影響

25、   3.4.1端粒長(zhǎng)度和端粒酶活性的改變:與正常對(duì)照組和DMSO組相比較,中溫煤焦瀝青組第20代和第30代細(xì)胞端粒DNA相對(duì)長(zhǎng)度變短、端粒酶相對(duì)活力增高差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而第10代正常對(duì)照組,DMSO組和中溫煤焦瀝青組相比較,各組之間各指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
   3.4.2 POT1、TRF1和TRF2基因mRNA表達(dá)水平變化:與正常對(duì)照組和DMSO組相比較,中溫煤焦瀝青組第20代和第30代細(xì)胞POT1和TRF1基因m

26、RNA表達(dá)水平下調(diào)、TRF2基因mRNA表達(dá)水平上調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而第10代3組之間各指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
   3.4.3 POT1、TRF1和TRF2基因蛋白表達(dá)水平變化:與正常對(duì)照組和DMSO組相比較,中溫煤焦瀝青組第20代和第30代細(xì)胞POT1和TRF1蛋白表達(dá)水平降低、TRF2蛋白表達(dá)水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而第10代3組之間各指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
   結(jié)論:煤焦瀝青煙提取物成分復(fù)雜,主

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