原發(fā)性乳腺癌染色體不穩(wěn)定性的相關(guān)研究.pdf

1、研究背景: 乳腺癌目前已經(jīng)成為全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，嚴重影響著女性的生命和健康。乳腺癌是一種多基因參與的復(fù)雜疾病，參與調(diào)控細胞生長、分化與凋亡的一系列染色體異常導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生。更好的認識其基因改變能為患者提供更為精確的診斷和合理的治療。 染色體不穩(wěn)定性是指癌細胞較之于正常細胞，在細胞分裂時喪失和（或）獲得整條染色體或染色體片段頻率的升高，可以具體的分為數(shù)目改變和結(jié)構(gòu)改變。染色體不穩(wěn)定是惡性腫瘤的最基本特征，幾乎

2、所有人類腫瘤都存在染色體不穩(wěn)定，對腫瘤惡性生物學(xué)行為的判斷具有重要價值。 過去大批基因表達圖譜分析發(fā)現(xiàn)了一系列的乳腺癌分子異常和一些對臨床診斷治療有用的基因表達亞型。但是由于分辨率的不足，比較基因組雜交（comparative genomic hybridization，CGH）等常用方法確定基因組的DNA拷貝數(shù)的能力受到限制。最新的細胞分子遺傳學(xué)技術(shù)進展為我們提供了高分辨率檢測細胞染色體不穩(wěn)定性的一個平臺。采用代表性寡核苷酸芯

3、片分析（representational oligonucleotide microarray analysis，ROMA）和定量多基因熒光原位雜交（quantitative multi-gene FISH，QM-FISH）使得對腫瘤基因組進行高分辨率分析成為可能。ROMA是迄今為止敏感性和特異性最強的微陣列雜交技術(shù)。QM-FISH技術(shù)可在同一細胞核內(nèi)檢測多個不同基因，并且可用于石蠟包埋組織。使用ROMA技術(shù)，可以尋找有意義的染色體異常

4、，確定研究靶向，而使用QM-FISH技術(shù)則能檢測細胞內(nèi)具體位點的拷貝數(shù)改變（copy number alterations，CNAs），反映單個細胞的基因改變，對有意義的基因進行深入研究。兩種技術(shù)結(jié)合，可以發(fā)現(xiàn)更廣泛的基因擴增、缺失和易位。 p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，但并非所有的惡性腫瘤都存在p53突變。MDM2（murine double minute2）和MDMx是是兩種重要的p53負性調(diào)節(jié)因子。MD

5、M2與MDMx擴增或過表達頻發(fā)于原發(fā)性乳腺癌，其中大部分腫瘤表達野生型P53蛋白。 本研究分為兩部分。第一部分在前期對原發(fā)性乳腺癌ROMA研究的基礎(chǔ)上，采用QM-FISH對人乳腺癌染色體改變進行高分辨率檢測，篩選出一組特異性分子標記物，用于系統(tǒng)的鑒定不同患者的分子異常，并且檢測同一腫瘤導(dǎo)管內(nèi)癌與浸潤性導(dǎo)管癌之間的分子表達差異，研究特定分子異常在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制。第二部分研究MDMx-MDM2-p53在在乳腺癌發(fā)生中的作

6、用機制。該研究將提高我們對乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中遺傳學(xué)改變的認識，為乳腺癌病理診斷、預(yù)后評估以及制定個體化治療方案提供理論基礎(chǔ)。 研究方法: 收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院2005-2006年乳腺癌34例，所有病例均為原發(fā)性乳腺癌，同時包含原位癌和浸潤癌。分別取所有石蠟標本腫瘤原位癌與浸潤癌組織制作組織芯片。圖像細胞學(xué)分析腫瘤細胞DNA倍體。根據(jù)ROMA檢測結(jié)果，篩選在乳腺癌中擴增或缺失比較頻繁的30個基因，使用UCSC（Unive

7、rsity of California，Santa Cruz）genome browser選擇設(shè)計探針，Qiagen（）質(zhì)粒純化試劑盒分離提取BAC克隆，切口平移法對分離純化的探針進行熒光素標記，QM-FISH法檢測30個基因的拷貝數(shù)改變，同一視野照相記錄。使用激光掃描共聚焦顯微鏡進行圖像采集，Axio Vision分析軟件進行圖像分析。并比較30個基因在導(dǎo)管內(nèi)癌與浸潤性導(dǎo)管癌中的拷貝數(shù)差異，以及與臨床病理指標之間的關(guān)系。FISH檢測3

8、4例原發(fā)性乳腺癌p53，MDMx與MDM2的基因拷貝數(shù)，免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測P53與MDM2蛋白表達情況，分析三種基因之間的相互作用以及與臨床病理指標之間的聯(lián)系。 實驗結(jié)果: 1．34例乳腺癌中，11例為二倍體腫瘤即D-tumor（32％），23例為非整倍體腫瘤即A-tumor（68％）。 2．QM-FISH檢測34例原發(fā)性乳腺癌中30個候選基因的拷貝數(shù)，所有病例均發(fā)生了兩個或兩個以上的基因改變，平均每例乳腺癌6

9、．5個基因發(fā)生數(shù)目增益或缺失。 3．CCNE2，C-erbB2，IGFIR，CKS1a，c-myc，CCND1擴增和chk1，p53，Rb1，CDH1，chk2，Nek9缺失均見于25％以上的病例，其中MDMx擴增（59％）最為常見。 4．34例腫瘤浸潤癌成分共發(fā)生222個基因異常事件，原位癌成分共檢測到194個基因異常事件，差異無顯著性，部分基因拷貝數(shù)僅在少數(shù)病例的導(dǎo)管內(nèi)癌和浸潤癌中基因有差別，無顯著差異。 5

10、．在檢測的30個基因中，我們發(fā)現(xiàn)了多種基因異常存在相關(guān)性。包括CCND1擴增與chk1缺失呈正相關(guān)（P<0．05）；c-myc擴增與C-erbB2擴增、CCNE2擴增、LZST1缺失正相關(guān)（P<0．05），其中c-myc、LZST1與CCNE2基因改變相互之間存在相關(guān)關(guān)系（P<0．01），p53缺失與MDMx擴增呈負相關(guān)（P<0．05）。 6．CNAs在組織學(xué)分級高（Ⅱ級與Ⅲ級）的腫瘤、非整倍體腫瘤和腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性腫瘤更為常

11、見（P<0．05），并且不同的臨床病理亞型有不同的CNAs。 7．34例原發(fā)性乳腺癌中，16例存在p53雜合性缺失，20例存在MDMx擴增，MDM2擴增僅有1例，但27例顯示MDM2蛋白過度表達。 8．MDM2過表達或者p53功能異常見于33例腫瘤，但二者不同時出現(xiàn)（P<0．01）；31例腫瘤有MDM4擴增與P53功能異常，二者呈負相關(guān)（P<0．05）。 結(jié)論: 1．多種基因異常（基因擴增、缺失）參與了乳

12、腺癌的發(fā)病與進展。 2．MDMx，CKS1a，CCNE2，IGF1R，C-erbB2，c-myc，CCND1擴增與chk1，chk2，Rb1，p53，CDH1缺失是原發(fā)性乳腺癌常見的染色體異常，可視為乳腺癌相關(guān)基因，對于乳腺癌早期診斷和預(yù)后判斷具有重要意義。 3．原位癌和浸潤癌基因拷貝數(shù)改變基本一致，即與浸潤癌有同等程度的基因組不穩(wěn)定性，是一種遺傳學(xué)上處于進展期的病變。 4．CNAs在體積較大的腫瘤、非整倍體腫瘤

13、和腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性腫瘤更為常見，且不同臨床病理亞型的乳腺癌有不同的CNAs。 5．乳腺癌中出現(xiàn)多種細胞周期調(diào)控基因擴增/缺失，細胞周期失控與惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。 6．乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個多基因參與的過程，諸多基因相互作用、相互影響，單一基因改變不能完滿解釋這一過程，進行多個基因之間相互作用的研究，能更好地從分子水平上闡述它們之間的聯(lián)系和腫瘤發(fā)生的機制，大樣本分析對于深入研究乳腺癌多基因異常之間的聯(lián)系有幫助。