乳腺癌腫瘤細胞增殖、染色體不穩(wěn)定性及CCND1和chk1基因改變的研究.pdf

1、研究背景：乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，嚴重威脅女性的生命健康。檢測和分析腫瘤細胞DNA含量與DNA倍體對腫瘤惡性生物學行為的判斷具有重要的價值。在乳腺癌中，非整倍體腫瘤較二倍體腫瘤生長迅速，侵襲性強。比較基因組雜交檢測結果顯示，非整倍體腫瘤較二倍體腫瘤具有更多的基因改變，包括基因重排、基因缺失、基因擴增等。除了染色體不穩(wěn)定性外，乳腺癌腫瘤細胞的高增殖狀態(tài)與腫瘤生長、演進、遠處轉(zhuǎn)移、死亡及化療敏感性密切相關。免疫組化檢測增殖細胞標記物，如

2、Ki67、各種細胞周期蛋白，能反映腫瘤細胞的增殖水平。有研究表明Ki67和cyclinA表達高與乳腺癌預后差有關。 chk1的多態(tài)性或缺陷增加了基因的不穩(wěn)定性，有助于具有突變表型的腫瘤細胞的形成和發(fā)展。CCND1和chk1基因的正常對于細胞周期的正常調(diào)節(jié)和基因穩(wěn)定性有作用。利用高分辨率熒光原位雜交技術可以直觀地檢測乳腺癌石蠟標本中CCND1和Chk1基因拷貝數(shù)的改變。 本研究分為兩部分。第一部分研究內(nèi)容是分析腫瘤細胞增殖

3、活性和基因不穩(wěn)定性在乳腺癌預后中的作用。由于腫瘤存在異質(zhì)性，不同區(qū)域腫瘤細胞的增殖水平不同。為了準確比較兩增殖指標，本課題采用了連續(xù)組織切片，檢測乳腺癌腫瘤標本中Ki67和cyclinA的表達，計數(shù)相同組織學視野Ki67和cyclinA的陽性細胞百分數(shù)。將腫瘤細胞增殖水平和DNA倍體結合，同時考慮患者腋窩淋巴結轉(zhuǎn)移情況和腫瘤大小，篩選出與乳腺癌遠處轉(zhuǎn)移發(fā)生有關的高風險組和低風險組患者。對378例有9年以上完整隨訪資料的乳腺癌患者進行生存

4、曲線及Cox多因素回歸分析，探討腫瘤細胞增殖水平、DNA倍體、組織學分級、腫瘤大小和腋窩淋巴結轉(zhuǎn)移情況與患者乳腺癌復發(fā)和死亡的關系。我們同時分析了cyclinA/Ki67比值及cyclinA細胞漿表達與乳腺癌惡性生物學行為的關系。第二部分，我們選擇了33例浸潤性導管同時伴有灶性導管原位癌(DCIS)分化的石蠟標本，應用高分辨率FISH技術檢測CCND1和Chk1基因拷貝數(shù)的改變，分析兩者與臨床病理各指標間的關系。同時探討了cyclinD

5、1蛋白的表達及細胞內(nèi)的分布及與CCND1擴增的關系。兩部分內(nèi)容結合，從不同分子水平探討了腫瘤細胞增殖、細胞周期調(diào)節(jié)和基因不穩(wěn)定性與乳腺癌惡性行為和患者預后的關系。 方法：第一部分：收集瑞典卡羅林斯卡醫(yī)院1998-1999乳腺癌患者428例，其中378例有完整的9年以上隨訪資料。所有石蠟標本4μm連續(xù)切片，免疫組化檢測Ki67、cyclinA表達情況。兩位病理醫(yī)生顯微鏡下觀察Ki67和cyclinA的表達，對每一病例選取5-14個

6、形態(tài)學相同的高倍鏡視野進行照相，傳出到電腦。兩人分別計數(shù)Ki67和cyclinA表達的陽性細胞百分數(shù)。根據(jù)ROC曲線分析結果，Ki67陽性細胞數(shù)大于15％的腫瘤定義為高增值水平腫瘤，反之為低增殖水平腫瘤。采用Feulgen染色方法檢測乳腺癌印片標本DNA倍體。DNA倍體主峰值在1.5c-2.5c之間且<10％的腫瘤細胞超過2.5c的腫瘤定義為二倍體腫瘤。DNA倍體主峰值位于二倍體區(qū)域之外以及DNA倍體分布超過四倍體范圍的腫瘤定義為非整倍

7、體腫瘤。SPF值通過計算DNA分布獲得。 第二部分：選擇山東大學附屬齊魯醫(yī)院手術切除乳腺浸潤性導管癌標本61例，免疫組化檢測ER、PR、Her2、Ki67、P53、cyclinD1蛋白的表達情況。高分辨率多色FISH檢測了33例伴有DCIS成分的浸潤性導管癌石蠟切片CCND1和chkl基因拷貝數(shù)的改變。SPSSforWindowsversion15.0軟件對以上兩部分試驗結果進行數(shù)據(jù)分析。 結果：1、不同組織學分級、腫瘤

8、大小分組、DNA倍體分組，Ki67和cyclinA表達均有統(tǒng)計學差異。在有無腋窩淋巴結轉(zhuǎn)移分組，未發(fā)現(xiàn)Ki67和cyclinA表達有統(tǒng)計學差異。SPF值僅在不同DNA倍體分組有顯著性統(tǒng)計學差異，在其他分組未見有統(tǒng)計學差異。 2、Ki67和cyclinA陽性細胞百分數(shù)，以及SPF值兩兩相關。Ki67和cyclinA的相關系數(shù)是0.9，Ki67和SPF的相關系數(shù)是0.67，cyclinA和SPF的相關系數(shù)是0.68。 3、與

9、乳腺癌遠處轉(zhuǎn)移相關的Ki67和cyclinA陽性細胞百分數(shù)分界點分別為15％和8％。增殖水平低的腫瘤，發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的百分率分別為6.8％和7.2％；而增殖水平高的腫瘤，發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的百分率分別為24.9％和27.9％。兩組比較有統(tǒng)計學差異。 4、非整倍體腫瘤較二倍體腫瘤更易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，尤其是T1NO腫瘤，D-tumors的遠處轉(zhuǎn)移率是2-3％；A-tumors的遠處轉(zhuǎn)移率高達20-25％。在T2NO，T1N+和T2N+腫瘤中，

10、兩組間的轉(zhuǎn)移率無統(tǒng)計學差異。 5、對于腫瘤直徑小于2cm且無腋窩淋巴結轉(zhuǎn)移的腫瘤，不同增殖水平的D-tumors發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的幾率小于4％；A-tumors發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的危險性視腫瘤細胞的增殖情況而定，增殖水平低的A-tumors與同組的D-tumors一樣，發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的幾率較低，但增殖水平高的A-tumors，遠處轉(zhuǎn)移的幾率則接近30％，與前兩組相比具有統(tǒng)計學差異。 6、對于腫瘤直徑大于等于2cm且無腋窩淋巴結轉(zhuǎn)移的

11、腫瘤和腫瘤直徑小于2cm但有腋窩淋巴結轉(zhuǎn)移的腫瘤，無論DNA倍體如何，所有低增殖水平的的腫瘤發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的風險較T1NO腫瘤輕度增加，高增殖水平的的腫瘤發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的風險明顯增加。 7、對于腫瘤直徑大于等于2cm且有腋窩淋巴結轉(zhuǎn)移的腫瘤，無論腫瘤細胞的倍體和增殖水平如何，發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的幾率均較高。 8、多因素Logistic回歸分析顯示，對于有腋窩淋巴結轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，腫瘤細胞增殖水平高是判斷是否發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的最主要危

12、險因素；而對于無腋窩淋巴結轉(zhuǎn)移的患者，腫瘤細胞非整倍體則是最主要的危險因素。 9、cyclinA/Ki67比值高的腫瘤較比值低的腫瘤，遠處轉(zhuǎn)移率高，兩組腫瘤轉(zhuǎn)移率比較，有統(tǒng)計學差異，尤其是在有腋窩淋巴結轉(zhuǎn)移的患者，cyclinA/Ki67比值高的腫瘤更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。 10、Ki67或cyclinA高表達腫瘤較低表達腫瘤無復發(fā)和總的生存時間短，兩者有統(tǒng)計學差異。在Ki67低表達組，有14.9％的患者復發(fā)，14.3％的患者死

13、亡；而在高表達組，復發(fā)率和死亡率分別為48.4％和34.6％。 11、按組織學級別、腫瘤大小和腋窩淋巴結受累情況分組，在T1、T2、NO、N+、G2+3各組腫瘤中，Ki67或cyclinA高表達較低表達腫瘤無復發(fā)和總的生存時間短，兩者比較有統(tǒng)計學差異。組織學Ⅰ級的腫瘤中，未發(fā)現(xiàn)上述統(tǒng)計學差異。 12、182例浸潤性導管癌COX回歸分析顯示，腫瘤細胞增殖水平是判斷患者復發(fā)和死亡的獨立的，最有意義的指標。 13、42

14、8例乳腺癌中，85例在cyclinA細胞核表達的同時，出現(xiàn)細胞漿陽性表達，cyclinA細胞漿表達與腫瘤組織學級別高、增值水平高、非整倍體和cyclinA/Ki67比值高有關。 14、61例乳腺癌中有53例出現(xiàn)CyclinD1蛋白細胞核表達，表達率為86.9％。53例CyclinD1陽性的病例中，11例同時伴有細胞漿CyclinD1過表達。細胞漿CyclinD1表達與細胞核CyclinD1陽性強和組織學分級高有關。 15

15、、9例有CCND1擴增的病例中，7例有明顯的細胞漿cyclinD1表達，而在24例無CCND1擴增的病例中，僅1例有細胞漿cyclinD1表達。CCND1擴增與細胞漿cyclinD1表達有統(tǒng)計學相關性。 16、9例有CCND1擴增的病例中，7例同時出現(xiàn)原位癌和浸潤性癌區(qū)域的CCND1擴增。另外兩例，僅在組織學分級Ⅲ級的浸潤性導管癌區(qū)域有CCND1擴增，而在低級別的DCIS區(qū)域無CCND1擴增。cyclinD1在上述DCIS區(qū)域呈

16、細胞核弱陽性表達，無胞漿表達；而在浸潤性癌區(qū)域cyclinD1細胞核和細胞漿均呈強陽性表達。 17、FISH結果顯示，33例乳腺癌中10例有Chk1基因的雜合性缺失，8例Chk1缺失的乳腺癌患者同時出現(xiàn)CCND1基因的擴增。CCND1基因擴增和Chk1基因雜合性缺失有關聯(lián)。 結論：1、Ki67和cyclinA表達高度相關，兩者的高表達與乳腺癌遠處轉(zhuǎn)移、復發(fā)和死亡早密切相關，兩者對于判斷乳腺癌患者預后具有同樣的價值。

17、 2、乳腺癌發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的低危險組包括T1N0組的所有D-tumors和同組低增殖水平的A-tumors、T2NO和T1N+兩組所有的低增殖水平腫瘤，低轉(zhuǎn)移危險組腫瘤占所有腫瘤的40％，其發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的危險性小于6％。 3、乳腺癌發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的高危險組包括所有T2N+腫瘤、除T1N0的D-tumors以外的所有高增值水平腫瘤，高轉(zhuǎn)移危險組發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的危險性高達35％。 4、cyclinA胞漿表達和cyclinA/Ki