非小細(xì)胞肺癌線粒體基因組不穩(wěn)定性的研究.pdf

1、線粒體是真核細(xì)胞細(xì)胞核外唯一含有自己的基因組的細(xì)胞器。作為細(xì)胞的“動(dòng)力工廠”，它在細(xì)胞的能量代謝、氧自由基生成和凋亡調(diào)控過程中扮演重要角色。哺乳動(dòng)物mtDNA(MitochondrialDNA，mtDNA)是一全長為16.5kb左右的雙鏈閉環(huán)分子，在長度僅為16.5kb左右的基因組內(nèi)，定位了2種rRNA、22種參與線粒體蛋白合成的tRNA和13種涉及呼吸作用和氧化磷酸化功能的多肽鏈基因。線粒體DNA為多拷貝基因，每個(gè)細(xì)胞器都含有數(shù)個(gè)到上

2、千個(gè)不等的線粒體，而每個(gè)線粒體可含有數(shù)個(gè)到數(shù)十個(gè)不等的線粒體DNA分子。與核基因組相比，其相對分子量小，缺乏組蛋白保護(hù)，缺乏損失修復(fù)系統(tǒng)等特點(diǎn)決定了它是致癌物作用的重要靶點(diǎn)。線粒體DNA突變發(fā)生率被認(rèn)為是核DNA的10-20倍。近年來，隨著對線粒體在細(xì)胞凋亡調(diào)控中的中心地位和誘發(fā)細(xì)胞癌變等腫瘤生物學(xué)過程中所起作用的進(jìn)一步了解，線粒體DNA突變成為目前腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。線粒體DNA突變目前已在各種腫瘤及腫瘤細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)。報(bào)道的mtDNA

3、遺傳改變包括，發(fā)生于編碼區(qū)及非編碼區(qū)(即控制區(qū))內(nèi)的各種點(diǎn)突變、片段缺失、重復(fù)或插入突變及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatelliteinstability，MSI)等。肺癌組織中mtDNA的大片段缺失狀況、控制區(qū)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和mtDNA的拷貝數(shù)有何改變?至今尚不清禁。mtDNA控制區(qū)微衛(wèi)星不穩(wěn)定及線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrialtranscriptionfact6rA，mtTFA)的表達(dá)對線粒體DNA拷貝數(shù)改變又有何影

4、響?也未見文獻(xiàn)報(bào)道。 目的： 一、明確mtDNA4977bp大片段缺失在肺癌組織、癌旁正常組織及非癌病人肺組織中的分布頻率，了解肺癌組織mtMSI發(fā)生的具體方式、位置以及它與年齡、吸煙及組織學(xué)病理類型等臨床指標(biāo)間的關(guān)系，探討mtDNA大片段缺失、控制區(qū)微衛(wèi)星不穩(wěn)定與腫瘤的相關(guān)性。 二、建立一種精確定量組織細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)的方法，了解肺癌組織中mtDNA的拷貝數(shù)的改變及其與肺癌的相關(guān)性，明確肺癌組織中線粒體轉(zhuǎn)

5、錄因子A的表達(dá)水平，探討mtDNA控制區(qū)微衛(wèi)星不穩(wěn)定、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A的表達(dá)與mtDNA拷貝數(shù)改變之間的關(guān)系。 方法： 本研究采用長距離PCR方法對37對肺癌組織及相應(yīng)的癌旁正常肺組織、20例非癌病人正常肺組織樣本mtDNA4977bp缺失突變進(jìn)行了檢測；采用PCR-SSCP和序列測定技術(shù)對37例肺癌組織線粒體DNA控制區(qū)的三個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行了分析；以核DNA作為定量mtDNA拷貝數(shù)的內(nèi)對照和以β-globin基因作為二

6、倍體核基因組含量的標(biāo)記，通過兩個(gè)單獨(dú)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，對組織細(xì)胞中線粒體DNA拷貝數(shù)進(jìn)行了精確定量(拷貝數(shù)/細(xì)胞)；采用RT-PCR方法檢測了肺癌中線粒體轉(zhuǎn)錄因子A的表達(dá)變化，并分析了mtDNA控制區(qū)微衛(wèi)星不穩(wěn)定、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A的表達(dá)與mtDNA拷貝數(shù)改變之間的關(guān)系。 結(jié)果： 一、肺癌組織、癌旁正常肺組織及非癌病人正常肺組織中均檢測出線粒體DNA4977bp片段缺失。37例肺癌組織標(biāo)本中20例(54.1％)檢測到4

7、977bp缺失，37例相應(yīng)的癌旁肺組織22例(59.5％)有缺失，其中14例是肺癌組織和癌旁正常組織均有缺失，8例在肺癌組織中未發(fā)現(xiàn)而卻在癌旁正常組織檢測到缺失。20例非癌病人正常肺組織中也有6例(30％)出現(xiàn)4977bp片段缺失。mtDNA4977bp缺失率有隨年齡增大而增高的趨勢，以年齡55歲，將組織樣本分為高年齡組和低年齡組。高年齡組4977bp缺失率顯著高于低年齡組(P＜0.01)。吸煙和不吸煙者之間缺失發(fā)生率有顯著差異(P＜0

8、.01)，曾經(jīng)吸煙和不吸煙者之間缺失發(fā)生率有顯著差異(P＜0.01)，而吸煙和曾經(jīng)吸煙之間缺失發(fā)生率無明顯差異(P＞0.05)。 二、37例肺癌樣本中共檢出mtMSI12例(32.4％)，mtMSI發(fā)生率為32.4％(12/37)。其中1個(gè)位點(diǎn)mtMSI陽性者11例(29.7％)，有2個(gè)位點(diǎn)(D310和D16184)mtMSI陽性者1例(2.7％)。12例mtMSI中，2例為同質(zhì)性，其余10例為異質(zhì)性突變。微衛(wèi)星位點(diǎn)序列測定結(jié)果

9、發(fā)現(xiàn)，12例mtMSI中，9例為堿基的缺失或插入，3例為nt16，189bp處的T核苷酸發(fā)生的T→C的點(diǎn)突變。 三、建立了一種精確定量組織細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)的方法。肺癌組織線粒體DNA的平均拷貝數(shù)/細(xì)胞為395±125，而相對應(yīng)的正常肺組織為733±196，前者顯著低于后者(p＜0.001)。含有mtMSI的12例肺癌組織其線粒體DNA的平均拷貝數(shù)顯著低于其余的肺癌組織(p＜0.05)。 四、癌組織和癌旁正常組織mt

10、TFAmRNA的平均表達(dá)量之間并無顯著差異。線性回歸分析結(jié)果表明，癌旁正常組織中，mtTFAmRNA的表達(dá)量和線粒體DNA拷貝數(shù)之間有直接的相關(guān)性(r=0.910，p＜0.01)；而在癌組織中，線粒體DNA拷貝數(shù)和mtTFAmRNA的表達(dá)水平無關(guān)(r=0.135，p＞0.05)。 結(jié)論： 一、肺癌組織、癌旁正常肺組織及非癌病人正常肺組織中均存在者線粒體DNA大片段缺失。部分病例中肺癌組織中未發(fā)現(xiàn)而卻在癌旁正常組織檢測到缺

11、失。肺癌和癌旁組織線粒體DNA4977bp大片段缺失的發(fā)生率高于正常肺組織，但在正常肺組織，特別是吸煙者和老年人群中亦存在著較高的缺失發(fā)生率。說明線粒體DNA4977bp大片段缺失并非肺癌特異性突變，而與年齡、吸煙等因素密切相關(guān)，其可能反映了mtDNA損傷積累過程中環(huán)境和年齡因素的作用。 二、堿基的插入或缺失是mtDNAD303、D514微衛(wèi)星位點(diǎn)發(fā)生長度不穩(wěn)定的常見原因。而nt16，189bp處的T核苷酸發(fā)生的T→C的點(diǎn)突變是

12、D16184微衛(wèi)星位點(diǎn)長度不穩(wěn)定性發(fā)生的重要原因。肺癌mtMSI發(fā)生率與患者性別、年齡及腫瘤的病理類型無相關(guān)性，而與是否吸煙有關(guān)。mtDNA非編碼區(qū)的遺傳不穩(wěn)定性可能與腫瘤細(xì)胞中mtDNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄水平的變化和拷貝數(shù)的改變有關(guān),mtMSI在部分肺癌的發(fā)生發(fā)展中可能起一定作用。 三、肺癌組織線粒體基因組的拷貝數(shù)明顯降低。肺癌線粒體基因組拷貝數(shù)的改變和控制區(qū)內(nèi)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性具有相關(guān)性。線粒體DNA控制區(qū)關(guān)鍵位點(diǎn)或相鄰區(qū)域內(nèi)的遺傳

13、不穩(wěn)定性可能會(huì)影響mtDNA的復(fù)制，從而導(dǎo)致線粒體DNA拷貝數(shù)的降低。 四、肺癌中線粒體DNA拷貝數(shù)雖然下降，但mtDNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制的主要調(diào)節(jié)因子mtTFA的表達(dá)并沒有下調(diào)；說明在肺癌組織中控制mtDNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制的主要調(diào)節(jié)因子對線粒體DNA拷貝數(shù)的調(diào)控功能缺失。 五、線粒體DNA自身遺傳結(jié)構(gòu)的改變和mtDNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制的核調(diào)節(jié)因子調(diào)控功能的喪失等多種因素共同作用可能是導(dǎo)致腫瘤線粒體DNA拷貝數(shù)降低的原因；線粒體DNA遺