散發(fā)性結(jié)直腸癌線粒體基因組不穩(wěn)定的研究.pdf

1、結(jié)直腸癌(colorectal cancer CRC)，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率居惡性腫瘤第三位。據(jù)研究數(shù)據(jù)顯示，亞洲地區(qū)[1]尤其是經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)，CRC的發(fā)生率也迅速增長(zhǎng)，接近西方國(guó)家。隨著我國(guó)生活水平的不斷提高，飲食習(xí)慣的改變，總體發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)。因此，CRC嚴(yán)重威脅人們的健康，所以尋找CRC的發(fā)病機(jī)制成為人們研究的熱點(diǎn)。
　　 腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中，需要大量能量供給無(wú)限增殖的細(xì)胞，細(xì)胞的能量主要來(lái)自線粒體的有氧氧化和糖酵解

2、。以前認(rèn)為由于腫瘤生長(zhǎng)速度快，長(zhǎng)期處于缺氧狀態(tài)，因此糖酵解在腫瘤的供能方面起主導(dǎo)作用。近年來(lái)學(xué)者認(rèn)為兩種能量供應(yīng)途徑在腫瘤的形成過(guò)程中都起重要作用[2，3]。因此線粒體在腫瘤中的作用得到廣泛關(guān)注.線粒體DNA((Mitochondrial DNA，mtDNA)是真核細(xì)胞惟一的核外基因，mtDNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其在DNA復(fù)制和損傷修復(fù)方面的特性，使它的突變率比核染色體高10～100倍[4]。由于線粒體在誘發(fā)細(xì)胞癌變等腫瘤生物學(xué)過(guò)程中起著重要

3、作用，mtDNA突變成為目前腫瘤研究的熱點(diǎn)之一[5]。目前已在多種腫瘤及腫瘤細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)mtDNA突變。報(bào)道的mtDNA遺傳改變包括，發(fā)生于編碼區(qū)及非編碼區(qū)(即控制區(qū))內(nèi)的各種點(diǎn)突變、片段缺失、重復(fù)或插入突變及微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)等。CRC組織中mtDNA的大片段缺失狀況、控制區(qū)的突變及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和mtDNA的拷貝數(shù)有何改變？至今尚不清楚。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)CRC線粒體的研究較少，圍

4、繞它展開(kāi)研究可能對(duì)CRC的發(fā)生發(fā)展提供新的依據(jù)。
　　 目的：
　　 一、明確mtDNA4977bp大片段缺失在CRC組織、癌旁組織及正常對(duì)照腸黏膜組織中的分布頻率，了解CRC組織線粒體基因組控制區(qū)(D-loop)突變情況，以及線粒體微衛(wèi)星不穩(wěn)定(mitochondrial microsatellite instability，mtMSI)發(fā)生頻率及其與年齡、組織學(xué)病理類(lèi)型、核微衛(wèi)星不穩(wěn)定(nuclearmicrosat

5、ellite instability，nMSI)等指標(biāo)間的關(guān)系。
　　 二、用精確定量組織細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)的方法，了解CRC組織、癌旁正常組織中mtDNA拷貝數(shù)的改變及其與CRC預(yù)后之間的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1.本研究采用長(zhǎng)距離聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法對(duì)50例CRC組織及相應(yīng)的癌旁正常組織、20例正常人腸黏膜組織樣本mtDNA4977bp缺失突變進(jìn)行了檢測(cè)；
　　 2.采用長(zhǎng)距離PCR和序列

6、測(cè)定技術(shù)對(duì)50例CRC組織及相應(yīng)癌旁組織、20例正常人腸黏膜組織mtDNA控制區(qū)進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)其突變率；利用primer5.0軟件設(shè)計(jì)三對(duì)測(cè)序引物，將mtDNA的D-loop區(qū)分成三段進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用軟件BIOEDIT與已公布的劍橋序列比較以分析突變的頻率和分布，序列變化根據(jù)Mitomap網(wǎng)上數(shù)據(jù)判斷為多態(tài)性變異和體細(xì)胞突變位點(diǎn)；
　　 3.用熒光標(biāo)記PCR及STR掃描的方法對(duì)50例CRC患者編碼區(qū)五個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行了分析，

7、同時(shí)檢測(cè)患者核內(nèi)兩個(gè)單堿基微衛(wèi)星位點(diǎn)；并用卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)它與年齡、組織病理類(lèi)型、核MSI之間的關(guān)系；
　　 4.取我院病理科2005年的60例CRC及對(duì)應(yīng)的正常切緣石蠟標(biāo)本，每個(gè)蠟塊以10μm厚度連切5張，顯微切割挑出所需組織，提取總DNA。以核基因β-actin作為定量mtDNA拷貝數(shù)的內(nèi)對(duì)照，并將其作為二倍體核基因組合量的標(biāo)記，ND1基因代表mtDNA拷貝數(shù)，通過(guò)兩個(gè)單獨(dú)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，對(duì)組織細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)進(jìn)行計(jì)

8、算。計(jì)算拷貝數(shù)與年齡、性別、病理分型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，用log-rank試驗(yàn)及Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析。
　　 結(jié)果：
　　 一、CRC組織、癌旁正常組織及正常人腸黏膜組織中均檢測(cè)出mtDNA4977bp片段缺失。CRC組織標(biāo)本中檢測(cè)到mtDNA4977 bp的缺失率為10％(5/50例)，相應(yīng)的癌旁組織缺失率為18％(9/50例)有，其中3例CRC組織和癌旁正常組織均有缺失，6例在CRC組

9、織中未發(fā)現(xiàn)而卻在癌旁正常組織檢測(cè)到缺失。20例非癌病人正常腸黏膜組織中4977bp片段缺失率為15％(3/20例)。mtDNA4977bp缺失率有隨年齡增大而增高的趨勢(shì)，以年齡60歲，將組織樣本分為高年齡組和低年齡組。高年齡組4977bp缺失率顯著高于低年齡組(P<0.01)。
　　 二、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與人mtDNA文庫(kù)記錄的序列比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)50例CRC患者線粒體DNA的D-loop區(qū)突變率為32％(16/50)。16例

10、患者發(fā)現(xiàn)13個(gè)突變位點(diǎn)，突變類(lèi)型分別是：9個(gè)點(diǎn)突變，3個(gè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定，1個(gè)缺失突變。其中三個(gè)點(diǎn)突變發(fā)生在重鏈的復(fù)制起始區(qū)，四個(gè)點(diǎn)突變發(fā)生在高變區(qū)I。20例正常對(duì)照腸黏膜組織中發(fā)現(xiàn)2例的16184、16280位點(diǎn)發(fā)生突變(10％)，癌組織與正常組織相比突變率明顯高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。D303位點(diǎn)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定為11個(gè)，同質(zhì)性突變3個(gè)，異質(zhì)性突變8個(gè)，D514位點(diǎn)突變2個(gè)，D16184位點(diǎn)突變2個(gè)，均為異質(zhì)性突變。共發(fā)現(xiàn)5

11、2個(gè)核苷酸多態(tài)性變異位點(diǎn)。
　　 三、對(duì)五個(gè)線粒體編碼區(qū)微衛(wèi)星位點(diǎn)及兩個(gè)核微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果示：共檢出mtMSI15例，發(fā)生率為30％(15/50)，nMSI檢出11例，發(fā)生率為22％(11/50)，1例右半結(jié)腸癌患者全部位點(diǎn)均陽(yáng)性，5例患者BAT25陽(yáng)性，9例患者BAT26陽(yáng)性，6例患者ND1陽(yáng)性，2例患者ND2陽(yáng)性，1例患者COIII陽(yáng)性，2例患者ND5-1陽(yáng)性，8例患者ND5-2陽(yáng)性。
　　 四、線粒體非編碼區(qū)及編

12、碼區(qū)MSI發(fā)生率是38％(19/50)與患者性別、年齡及腫瘤的位置及病理類(lèi)型無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，而與核MSI有關(guān)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 五、CRC組織線粒體DNA的平均拷貝數(shù)/細(xì)胞為108.60±20.11，而相對(duì)應(yīng)的正常組織為153.68±25.72，前者顯著低于后者(p<0.001)。根據(jù)癌組織與癌旁組織的比值分成兩組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分界值為0.72，與臨床病理指標(biāo)比較后發(fā)現(xiàn)，拷貝數(shù)與年齡、性別、病理

13、分型、臨床分期無(wú)明顯相關(guān)性，而低拷貝數(shù)組30人中12人發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，高拷貝數(shù)組中只有5人。兩者呈負(fù)相關(guān)(p=0.045)。低拷貝值的患者3年無(wú)瘤生存率低于高拷貝值組，但兩者無(wú)顯著差異(P=0.089)。
　　 結(jié)論：
　　 一、結(jié)直腸癌變過(guò)程中，線粒體缺失不是導(dǎo)致CRC的主要原因。大片段缺失與年齡因素密切相關(guān)，反映了mtDNA損傷積累過(guò)程中環(huán)境和年齡因素的作用。
　　 二、線粒體控制區(qū)(D-環(huán)區(qū))52個(gè)核苷酸

14、多態(tài)性變異位點(diǎn)，32％(16/50)的體細(xì)胞突變率，提示D-環(huán)區(qū)是一個(gè)具有高度多態(tài)性的片段，并具有高度突變性。作為線粒體控制區(qū)的mtDNA非編碼區(qū)的遺傳不穩(wěn)定性可能引起mtDNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄水平的異常，從而導(dǎo)致腫瘤的形成。
　　 三、堿基的插入或缺失是CRC發(fā)生mtMSI的常見(jiàn)原因。錯(cuò)配修復(fù)基因不僅影響核基因還影響線粒體基因。mtMSI在部分CRC的發(fā)生發(fā)展中起一定作用。
　　 四、CRC組織線粒體基因組的拷貝數(shù)明顯降低，