剛地弓形蟲入侵宿主細胞過程中棒狀體蛋白16的分泌與分布.pdf

1、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種呈世界性分布的專性寄生于有核細胞內的原蟲，全球有三分之一以上的人口受其感染。人體可因食入含包囊的未熟的肉制品和被卵囊污染的食物或水而感染弓形蟲。作為一種機會致病性原蟲，正常人感染弓形蟲通常呈無癥狀帶蟲狀態(tài)，然而，當弓形蟲感染免疫功能缺陷者，如接受免疫抑制治療者、惡性腫瘤放療和艾滋病患者時，可在患者體內迅速增殖并廣泛散播，主要侵犯人腦、眼和淋巴結等，表現(xiàn)為多器官損害，甚至引起死亡。孕婦

2、在首次感染弓形蟲后可經(jīng)胎盤垂直傳播給胎兒，導致流產(chǎn)、早產(chǎn)、畸胎，死胎和新生兒眼弓形蟲病等。弓形蟲還可寄生于牲畜和鳥類，給畜牧業(yè)帶來損失。
　　弓形蟲主動入侵宿主，主要包括對宿主細胞的黏附、侵入、宿主細胞內陷形成納蟲空泡、對納蟲空泡進行修飾、速殖子分裂增殖、速殖子破細胞而出及轉化為緩殖子等階段。弓形蟲的頂端復合體在蟲體侵入宿主細胞中起著重要的作用，復合體上的分泌細胞器包括微線體、棒狀體和致密顆粒。棒狀體含有多種蛋白，在弓形蟲入侵宿主

3、細胞時，可迅速分泌至宿主細胞內或在蟲體入侵時分泌并被納入至納蟲泡膜(parasitophorus vacuole membrane，PVM)上，主要分布于納蟲泡膜、納蟲泡(Parasitophorous vacuole，PV)內和宿主細胞內（細胞核和細胞質），一般將棒狀體蛋白(Rhoptry Protein，ROPs)分為兩個家族:ROP1、ROP2蛋白家族。ROP1蛋白家族的代表性成員ROP1最初被稱為穿透增強因子(Penetrati

4、on enhancer factor，PEF)，在入侵宿主細胞的早期階段有促進作用，弓形蟲一旦侵入宿主細胞，一部分成熟的ROP1蛋白便立即和PVM聯(lián)合，并集中在PV中，但在入侵過程完成后的幾小時內，ROP1的量顯著降低甚至消失，而另一部分的ROP1則存在于納蟲空泡中。ROP2家族對弓形蟲入侵感染和形成納蟲空泡都是至關重要的效應因子，其成員包括ROP2、ROP3、ROP4、ROP5、ROP7、ROP8、ROP16和ROP18，如ROP2、

5、ROP4、ROP5、ROP7、ROP18等參與了納蟲空泡的形成。PV為一個非融合性小室，弓形蟲在入侵宿主細胞后可寄居于內，PVM為弓形蟲免受宿主細胞清除提供了保護屏障，弓形蟲在PV內依靠宿主細胞提供的營養(yǎng)物質迅速增長繁殖并破壞宿主細胞，最后從遭弓形蟲破壞而致裂解的宿主細胞中逸出并再次侵入鄰近的新細胞中，如此往復。近期研究表明，ROP2家族不僅在蟲體入侵宿主、納蟲空泡修飾和毒力作用方面表現(xiàn)突出，ROP18、ROP16及ROP5還是重要的弓

6、形蟲毒力決定因子，弓形蟲ROP18可通過干擾免疫相關性GTP酶(IRGs)系統(tǒng)來抑制宿主固有免疫應答，還可靶向作用在內質網(wǎng)膜上的轉錄激活因子ATF6β來抑制宿主的適應性免疫應答，使弓形蟲具備強毒力，而ROP16借助自身的核定位結構(nuclear localization signal，NLS)，在侵入宿主細胞后，迅速移位至宿主細胞核，使宿主細胞內的信號傳導與轉錄激活因子(signal transducer and activatoro

7、f transcription，STAT) STAT3/STAT6發(fā)生磷酸化，影響宿主細胞內信號通路傳導，從而干擾宿主細胞的增殖、分化、凋亡等功能。據(jù)報道，不同弓形蟲株間ROP16的基因序列呈多態(tài)性。弓形蟲感染宿主后，宿主的巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞會釋放IL-12等細胞因子，誘導繼發(fā)性免疫反應或直接清除寄生蟲。Ⅰ型蟲株感染細胞后，ROP16可迅速激活STAT3，隨后抑制促炎因子如IL-12的釋放，而在Ⅱ型卻未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。

8、　　不同蟲株ROP16的作用不盡相同，那么不同蟲株在入侵宿主細胞過程中，ROP16的分泌和分布情況如何呢？本研究通過對弓形蟲ROP16進行原核表達，制備其多克隆抗體，運用實時熒光定量PCR實驗比較不同蟲株在入侵宿主細胞過程中ROP16轉錄水平的差異，相應地，制備抗弓形蟲微管蛋白Tubulin抗體，在運用免疫印跡比較RH株和Pru株ROP16的表達量時作為內參抗體，為深入研究不同蟲株ROP16在弓形蟲入侵宿主細胞過程中的作用及闡明弓形蟲的

9、致病機制提供依據(jù)。
　　二、研究目的
　　弓形蟲入侵宿主細胞是一個從吸附到宿主細胞膜、隨后宿主細胞膜內陷形成納蟲泡、入侵到細胞內、汲取宿主細胞營養(yǎng)完成自身生長及繁殖和逸出舊宿主細胞侵染鄰近新宿主細胞的連續(xù)性過程。在這個過程中，弓形蟲頂端復合體上的分泌細胞器起著重要作用，其分泌出的蛋白包括微線體蛋白、棒狀體蛋白、致密顆粒蛋白，其中棒狀體蛋白在入侵過程中起了關鍵性作用。本研究的目的是了解弓形蟲不同毒力株的ROP16在轉錄水平與蛋

10、白水平是否一致，并掌握在入侵宿主細胞后，弓形蟲分泌出的ROP16在宿主細胞中的定位。
　　三、研究方法
　　1.制備抗弓形蟲棒狀體蛋白16(ROP16)多克隆抗體
　　因為弓形蟲ROP16基因無內含子，以弓形蟲RH株速殖子基因組DNA為模板，PCR擴增弓形蟲ROP16編碼基因序列，克隆至載體pET-32a(+)，在大腸埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導表達。純化重組蛋白TgROP16，進行動物免疫

11、，取兔血清，制備其兔源多克隆抗體，利用間接ELISA檢測血清的抗體滴度，隨后純化抗體，運用SDS-PAGE檢測抗體的純度，及運用免疫印跡檢測抗體特異性。
　　2.制備抗弓形蟲微管蛋白Tubulin多克隆抗體
　　以弓形蟲RH株速殖子cDNA為模板，PCR擴增弓形蟲tubulin編碼基因序列，克隆至載體pET-32a(+)，在大腸埃希菌(E.coli) BL21中，經(jīng)IPTG誘導表達，SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白TgTub

12、ulin是否為可溶性蛋白，大量誘導表達后，純化重組蛋白TgTubulin，動物免疫，取兔血清，利用間接ELISA檢測血清的抗體滴度，獲得滿意滴度后純化抗體，運用SDS-PAGE檢測抗體的純度，及運用免疫印跡檢測抗體特異性。
　　3.實時熒光定量PCR比較不同蟲株基因ROP16在轉錄水平上的差別
　　分別收集RH株和Pru株的蟲體，提取其總RNA，隨后進行逆轉錄。以cDNA為模板，通過設計特異引物，擴增內源參照基因弓形蟲GAP

13、DH和弓形蟲基因Tgrop16，建立兩種基因的拷貝數(shù)-CT標準曲線。比較兩種不同蟲株Tgrop16的基因表達量。
　　4.蛋白質印跡檢測RH及Pru蟲株等量總蛋白時ROP16的蛋白量
　　分別收集RH株和Pru株的總蛋白，使用western細胞裂解液充分裂解弓形蟲蛋白，利用BCA法測蛋白濃度，隨后運用蛋白質印跡檢測加入等量RH株及Pru株總蛋白時ROP16的蛋白量，選用已制備好的兔抗TgTubulin抗體作為內參，兔抗TgR

14、OP16多克隆抗體作為一抗，稀釋比例為1∶1000，HRP標記的羊抗兔IgG為二抗。最后加入顯色液，拍照，觀察目的條帶。
　　5.應用兔抗TgROP16多克隆抗體進行免疫熒光染色，檢測RH及Pru株弓形蟲在入侵宿主細胞過程中，TgROP16在宿主細胞中的分泌與分布。
　　無菌條件下，放置蓋玻片于6孔板內，將HFFs細胞平分至孔內，DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞覆蓋率達90％-100％(37℃，5％CO2)，留一組不感染弓形蟲的

15、HFFs細胞，作為陰性對照。分別向兩孔內加入感染復數(shù)為10的RH株和Pru株弓形蟲懸液感染細胞，4小時后，棄掉培養(yǎng)基并用PBS振蕩洗滌三次后，加入多聚甲醛固定細胞，37℃靜置30min，PBS振蕩洗滌三次。再加入透化液250μl覆蓋細胞后室溫靜置10min，PBS振蕩洗滌三次。加入封閉液覆蓋細胞，37℃孵育1h，棄去封閉液。加入用封閉液稀釋好的兔抗TgROP16多克隆抗體(1∶200)，4℃搖床孵育過夜，PBS振蕩洗滌三次，加入二抗山羊

16、抗兔FITC-IgG(1∶100)，37℃封閉孵育1h，PBS振蕩洗滌三次，加入10nM DAPI(1∶5000)避光染色10min，PBS振蕩洗滌三次。向蓋玻片中央滴加10l抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。
　　四、實驗結果
　　1.成功表達并純化了重組蛋白TgROP16，獲得特異性良好的兔源多克隆抗體;間接ELISA結果顯示，抗體滴度為1∶25600;
　　2.實時定量熒光PCR結果顯示Pru株ROP16的

17、表達量(7.786±0.206)是RH株(1.000±0.110)的7倍（P＜0.05）;
　　3.蛋白質印跡結果顯示，RH株(RH株ROP16與其內參tubulin的比值為0.373) ROP16的蛋白表達量略高于Pru株(Pru株ROP16與其對應內參Tubulin的比值為0.232);
　　4.間接免疫熒光結果顯示在未入侵的RH、Pru蟲體中，ROP16定位于其頂端復合體，而在已入侵的蟲體中，未見ROP16在頂端復合體