細胞Rho和Rac GTP酶在剛地弓形蟲入侵宿主細胞過程中的作用研究.pdf

1、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是細胞內(nèi)寄生原蟲，能感染多種有核細胞，全世界約有三分之一的人口隱性感染弓形蟲。弓形蟲感染人體后，在免疫正常人群可由急性感染快速地轉(zhuǎn)為隱性感染，因而危害不明顯;而在免疫抑制患者體內(nèi)會廣泛散播，寄生于有核細胞引起炎癥，弓形蟲主要損害腦、眼和淋巴結(jié)，甚至會引起死亡;在孕婦感染后，弓形蟲可通過胎盤傳播給胎兒，造成流產(chǎn)、死產(chǎn)、死胎、畸胎或新生兒弓形蟲病。人類感染弓形蟲的途徑主要是通過誤食未煮熟的中間

2、宿主的肉或被終宿主（貓）排泄的卵囊污染的食物。
　　 弓形蟲感染宿主后會刺激機體產(chǎn)生免疫反應以抵抗弓形蟲感染，在感染早期，細胞免疫反應在機體內(nèi)發(fā)揮主要抗感染作用。免疫的形成雖可有效地限制感染的發(fā)展和新?lián)p傷的形成，但一般并不能消除弓形蟲感染。多數(shù)研究者認為，弓形蟲具有帶蟲免疫的特點。機體只在感染過程中才對再感染具有一定程度的抵抗力，而蟲體清除后該種免疫力也消失。弓形蟲可以在機體免疫反應環(huán)境中保持存活，主要是通過在弓形蟲納蟲泡內(nèi)保持

3、良好增殖和干擾宿主細胞信號轉(zhuǎn)導的方式進行的，但宿主免疫反應只能被部分削弱，而不是完全被消除。弓形蟲通過在誘導和抑制宿主免疫反應過程中保持著精致平衡，來保證在宿主細胞內(nèi)寄生、增殖并有機會傳播。弓形蟲入侵和寄生過程中有許多宿主細胞信號通路的參與并出現(xiàn)廣泛變化，在弓形蟲入侵、寄生、增殖及與弓形蟲-宿主細胞相互關系中起著重要的作用。
　　 弓形蟲感染宿主細胞的機制已被廣泛研究，在弓形蟲入侵時，速殖子是弓形蟲的主要致病蟲期，其在細胞內(nèi)寄生

4、和迅速繁殖破壞宿主細胞，逸出后的裂殖子又侵襲鄰近的細胞，如此反復，刺激淋巴細胞、巨噬細胞的浸潤，導致組織的急性炎癥和壞死。弓形蟲侵入細胞的過程依次為:附著于宿主細胞;伸出類錐體;進入宿主細胞;蟲體向后移動的運動連接(moving junction，MJ)形成;微線體的分泌作用;棒狀體的分泌作用;蟲體滑入納蟲空泡，在10s內(nèi)完成整個侵入過程，蟲體進入胞漿后運動較為緩慢，并且有向核移動的特性。在弓形蟲侵入宿主細胞過程中會形成納蟲泡(PV)，

5、在這個過程中，MJ會清除宿主細胞的一些組分（如跨膜蛋白），同時保留大部分的宿主細胞膜組分組成到納蟲泡膜(PVM)上，此外因宿主細胞膜中能與溶酶體和內(nèi)涵體融合的組分已被MJ過濾掉，使PV成為一個非融合小室，有助于其內(nèi)的速殖子抵抗宿主細胞內(nèi)含體的融合及溶酶體的酸化作用。
　　 GTP酶(GTPase)是能夠與三磷酸鳥苷(GTP)結(jié)合并在Mg2+作用下將其水解為二磷酸鳥苷(GDP)的超蛋白家族。小分子GTP酶是相對分子質(zhì)量為20 kD

6、a-40 kDa的單體調(diào)控性GTP酶，至少由5個家族組成，分別是:Ras、Rho、Rab、Sar1/Arf和Ran。目前研究較多的為Ras和Rho家族。其中Rho族蛋白主要包括Rho、Rac和Cdc42三個亞家族，這些蛋白最主要的功能是調(diào)節(jié)細胞骨架和肌動蛋白重組，其他功能包括調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、細胞周期和膜泡運輸?shù)取?br>　　 Rho GTP酶最主要的功能是調(diào)節(jié)肌動蛋白和細胞骨架的重組，從而調(diào)節(jié)細胞的形態(tài)變化和運動。該族蛋白的活化能促使細

7、胞外基質(zhì)的降解、破壞上皮層的結(jié)構(gòu)和增加細胞的運動性。Rho族蛋白的活化和失活在真核細胞的許多基礎性生命活動中都起著關鍵的作用。弓形蟲入侵宿主細胞的過程伴隨著宿主細胞結(jié)構(gòu)的重組，包括宿主細胞中心粒及高爾基復合體定位在納蟲泡上，線粒體、微管及溶酶體被納入了納蟲泡的邊緣。
　　 有文獻報道，弓形蟲感染宿主細胞時，免疫相關-GTP酶聚集在納蟲泡膜上導致納蟲泡膜的破裂及弓形蟲的死亡，這種GTP酶在納蟲泡膜上的聚集在弓形蟲入侵幾分鐘后就開始

8、了，然后在1小時內(nèi)逐漸增強。有研究表明宿主細胞的一種小分子GTP酶-ARF6參與了弓形蟲侵入Vero細胞時納蟲泡的形成。用RNAi的方法抑制Vero細胞中ARF6的表達，發(fā)現(xiàn)該細胞對弓形蟲的感染率顯著下降。并且ARF6在細胞膜上調(diào)節(jié)胞膜運輸及肌動蛋白細胞骨架重組，研究者指出保持宿主細胞肌動蛋白細胞骨架的完整對弓形蟲的入侵非常重要。干擾素-γ-介導的GTP酶-Irga6可以抵抗小鼠被弓形蟲感染，Irga6在未感染的細胞內(nèi)主要是以GDP非活

9、化結(jié)合狀態(tài)存在，但當弓形蟲感染細胞后Irga6會聚集在PVM上并且轉(zhuǎn)化為GTP活化狀態(tài)存在，Irga6的這種聚集最終導致PVM的破裂。此過程中需要一個完整的GTP結(jié)合域。其他原蟲如隱孢子蟲感染體外培養(yǎng)的人膽管上皮細胞時，誘導感染細胞中PI3K在納蟲泡膜上的聚集與活化，F(xiàn)rabin也參與了納蟲泡膜的形成，激活宿主細胞PI3K/Frabin信號通路，從而激活Cdc42通路，最終導致宿主細胞肌動蛋白在納蟲泡膜上的重組。GTP酶在弓形蟲入侵宿主

10、過程中起所起的重要作用促使我們進一步去探討，是否其它小分子GTP酶也同樣參與了弓形蟲感染宿主細胞的過程。
　　 本實驗的技術(shù)路線為是首先在弓形蟲感染細胞中，證實RhoGTP酶組成到弓形蟲PVM上，利用共聚焦顯微技術(shù)實時觀察弓形蟲入侵細胞過程中，RhoGTP酶在PVM上的聚集過程。其次利用基因點突變的方法尋找決定Rho GTP酶在PVM上聚集的決定性結(jié)構(gòu)域，最后利用體外轉(zhuǎn)染的方法證實酶活性是否影響弓形蟲入侵宿主細胞的效率。同時，運

11、用GST pull down和對感染細胞用EGF刺激檢測聚集在PVM上RhoGTP酶的活化狀態(tài)。
　　 通過實驗證實在弓形蟲速殖子入侵宿主細胞時，RhoA和Rac1 GTP酶可以聚集在弓形蟲PVM上，這種聚集依賴的是完整的GTP酶活性，并且無論是弓形蟲強毒株還是弱毒株RhoA和Rac1GTP酶在入侵時都會聚集。同時發(fā)現(xiàn)弓形蟲在開始入侵細胞時聚集就會發(fā)生且隨著入侵的繼續(xù)，PVM上的RhoAGTP酶仍不斷豐富聚集，推測此時聚集的GT

12、P酶來自宿主細胞膜或細胞質(zhì)，表皮生長因子不能刺激RhoAGTP酶在PVM上聚集和轉(zhuǎn)移，這說明RhoA和Rac1GTP酶在PVM上的聚集是以GTP活性形式存在。同時，弓形蟲入侵可以激活細胞內(nèi)源性RhoA和Rac1 GTP酶。實驗尋找到了決定RhoA GTP酶在PVM上的聚集決定于GTP/Mg2+結(jié)合及其下游效應因子mDia結(jié)合相關的結(jié)構(gòu)域，通過調(diào)節(jié)細胞微管蛋白來調(diào)節(jié)細胞骨架的重組。使細胞內(nèi)RhoA和Rac1 GTP酶缺失，可以導致細胞弓形

13、蟲速殖子感染率顯著降低，證明RhoA和Rac1GTP酶正?；钚栽诠蜗x入侵細胞過程中是必不可少的。
　　 RhoA和Rac1 GTP酶在PVM上的聚集和弓形蟲有效入侵時對RhoA和Rac1活性的依賴都顯現(xiàn)RhoA和Rac1 GTP酶在弓形蟲入侵宿主細胞時發(fā)揮著重要功能及作用。宿主細胞的RhoA和Rac1 GTP酶在弓形蟲入侵時參與了細胞骨架重組以促進納蟲泡的形成，細胞骨架的重組有利于弓形PVM的形成和擴大，有助于維持弓形蟲速殖子

14、在納蟲泡內(nèi)的分裂繁殖。
　　 目的:
　　 1.分析在弓形蟲感染宿主細胞時，宿主細胞的RhoA和Rac1 GTP酶是否組成到弓形蟲的PVM上。
　　 2.了解RhoA和Rac1 GTP酶負顯性突變體是否組成到弓形蟲的PVM上。
　　 3.分析弓形蟲速殖子感染后宿主細胞內(nèi)源性RhoA和Rac1 GTP酶的活化狀態(tài)。
　　 4.探討RhoA GTP酶在弓形蟲PVM上聚集時哪些結(jié)構(gòu)域是必須的。
　

15、　 5.分析聚集在PVM上的RhoA和Rac1 GTP酶的活性狀態(tài)是否依賴其本身的GTP酶活性。
　　 6.探討細胞RhoA和Rac1 GTP酶的缺失是否影響弓形蟲速殖子入侵宿主細胞效率。
　　 方法:
　　 1.轉(zhuǎn)染pECFP-RhoA-WT和pECFP-Rac1-WT質(zhì)粒于COS-7細胞，48hr后細胞分別用弓形蟲RH株和Pru株速殖子侵染2hr，4％多聚甲醛固定細胞30min后，用DAPI室溫下染色10

16、min，熒光顯微鏡下觀察CFP標簽的RhoA和Rac1是否被組成到納蟲泡膜上。
　　 2.弓形蟲RH速殖子感染16HBE細胞后，用間接免疫熒光法對內(nèi)源性RhoA和Rac1進行定位。
　　 3.弓形蟲速殖子感染轉(zhuǎn)染pECFP-RhoA-WT于COS-7細胞后，在感染后用共聚焦顯微法每5min實時觀察宿主細胞RhoA GTP酶在PVM上的聚集情況。
　　 4.分別轉(zhuǎn)染RhoA和Rac1負顯性突變體(pECFP-Rho

17、A-N19和pECFP-Rac1-N17)于COS-7細胞中，48hr后用速殖子侵染2hr，4％多聚甲醛固定細胞30 min后，用DAPI室溫下染色10min，熒光顯微鏡下觀察非活化的RhoA和Rac1是否會聚集在納蟲泡膜上。
　　 5.16HBE細胞用RH株速殖子感染后收集細胞，用RIPA試劑裂解，120 ug總蛋白用于Rho GST pull down，檢測弓形蟲入侵是否激活RhoA和Rac1 GTP酶。
　　 6.

18、以pECFP-RhoA-WT為親本質(zhì)粒，構(gòu)建RhoA每10個氨基酸缺失的突變體19個即M1-M19。將M1-M19轉(zhuǎn)化入COS-7細胞，48hr后用RH株速殖子侵染2hr，4％多聚甲醛固定細胞30 min后，用DAPI室溫下染色10min，熒光顯微鏡下觀察各突變體RhoA在納蟲泡膜上的聚集情況。
　　 7.COS-7細胞轉(zhuǎn)染pECFP-RhoA-WT后速殖子侵染2hr，100 nM EGF加于六孔板一角，激活5min后用多聚甲醛

19、固定細胞，DAPI室溫下染色，熒光顯微鏡下觀察RhoA的轉(zhuǎn)位情況。
　　 8.宿主細胞RhoA和Rac1的活性及存在與弓形蟲感染率關系的研究:
　　 a.正常COS-7細胞、COS-7細胞分別轉(zhuǎn)染pECFP-RhoA-WT、pECFP-RhoA-N19和pECFP-Rac1-WT、pECFP-Rac1-N17，48hr后速殖子侵染2hr，多聚甲醛固定細胞，Giemsa染色，計算細胞感染率并進行統(tǒng)計學分析，比較正常細胞與轉(zhuǎn)

20、染細胞的感染率是否有統(tǒng)計學差異。
　　 b.正常16HBE細胞及單獨轉(zhuǎn)染RhoA-siRNA、Rac1-siRNA和共同RhoA-siRNA和Rac1-siRNA轉(zhuǎn)染組的16HBE細胞，用速殖子侵染2hr，多聚甲醛固定細胞，Giemsa染色，計算細胞感染率并進行統(tǒng)計學分析，比較正常細胞與轉(zhuǎn)染細胞的感染率是否有統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.小分子GTP酶-RhoA和Rac1在弓形蟲感染宿主細胞時會在PVM上

21、聚集。
　　 2.RhoA和Rac1 GTP酶在PVM上的聚集以GTP酶活性狀態(tài)存在。
　　 3.弓形蟲速殖子的感染可以激活宿主細胞內(nèi)源性RhoA和Rac1 GTP酶。
　　 4.RhoA GTP酶依賴不同的RhoA結(jié)構(gòu)域在弓形蟲PVM上聚集。
　　 5.細胞RhoA和Rac1 GTP酶為弓形蟲速殖子有效入侵宿主細胞所必需。
　　 結(jié)論:
　　 1.無論弓形蟲弱毒株還是強毒株速殖子，宿主細

22、胞RhoA和Rac1 GTP酶在弓形蟲速殖子入侵時都會聚集在PVM上，而且這種聚集依賴其完整的GTP酶活性。
　　 2.弓形蟲速殖子感染細胞可以激活內(nèi)源性RhoA和Rac1 GTP酶，并且在弓形蟲剛開始入侵時RhoA和Rac1 GTP酶就會在PVM上聚集，聚集的RhoA和Rac1 GTP酶來自細胞膜或者細胞質(zhì)。
　　 3.決定RhoA在PVM上聚集的結(jié)構(gòu)域有:GTP/Mg2+結(jié)合位點、Mdia效應器作用位點、G1 box

23、、G2 box和G5 box。
　　 4.表皮生長因子(EGF)刺激感染的宿主細胞后，RhoA和Rac1 GTP酶在PVM上并沒有發(fā)生移位現(xiàn)象，這顯示RhoA和Rac1可能以GTP活化形式存在于PVM上。
　　 5.細胞過表達pECFP-RhoA-WT、pECFP-Rac1-WT、pECFP-RhoA-N19、pECFP-Rac1-N17和將細胞內(nèi)RhoA和Rac1 GTP酶基因沉默后對細胞感染率的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示RhoA和