剛地弓形蟲致小鼠睪丸生精細(xì)胞損傷機(jī)制的探討.pdf

1、本文研究目的：采用剛地弓形蟲速殖子急性感染BALB/c雄性小鼠，研究弓形蟲的雄性生殖毒性：①采用腹腔注射剛地弓形蟲速殖子的方法，建立弓形蟲急性感染致雄性生殖毒性的小鼠模型：監(jiān)測弓形蟲感染后雄鼠的一般狀況、睪丸重量、附睪重量、精子數(shù)量及形態(tài)的變化，并觀察小鼠睪丸的病理損傷，確定弓形蟲急性感染致小鼠生殖功能損傷的特點(diǎn)。②探討弓形蟲感染后小鼠睪丸生精細(xì)胞的損傷以及凋亡相關(guān)蛋白在睪丸細(xì)胞的表達(dá)，分析弓形蟲感染對睪丸內(nèi)不同倍體的生精細(xì)胞的損傷是否

2、具有選擇性；③檢測弓形蟲感染后小鼠血清睪酮(T)、促黃體生成素(LH)、睪丸組織內(nèi)T水平的變化，以及生精小管內(nèi)激素受體(LHR、AR)的變化，初步探討弓形蟲急性感染對生殖激素的水平及其作用通路的影響。通過以上實驗，探討弓形蟲急性感染致雄性生殖障礙的機(jī)制，為弓形蟲致雄性不育制定防治策略提供理論依據(jù)。 研究方法： (1)監(jiān)測弓形蟲感染后雄鼠的體重、睪丸重量、附睪重量、精子數(shù)量和形態(tài)的變化，并觀察睪丸的病理損傷。將BALB/c

3、雄鼠隨機(jī)分為6組，每組8只。正常A組：正常對照組(0.2mlPBS)：感染B組：弓形蟲感染組(B1組腹腔注射經(jīng)胰酶消化后的弓形蟲速殖子2.5×10<'3>個/只，B2組注射5×10<'3>個/只，B3組注射1×10<'4>個/只、B4組注射2×10<'4>個/只)；陽性C組：壞磷酰胺陽性對照組(40 mg/kg)。攻蟲后第6天，稱小鼠重量，頸椎脫臼法處死小鼠，摘取睪丸、附睪稱重，并制備附睪精子懸液，推片、1％伊紅染色，顯微鏡下計精子數(shù)及

4、觀察精子畸形；睪丸梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片(5μm)，HE染色，觀察睪丸的損傷情況和計睪丸生精小管內(nèi)精子數(shù)。 (2)探討弓形蟲感染后雄鼠生精細(xì)胞的損傷情況。將BALB/c雄鼠隨機(jī)分為6組，每組10只。正常A組：正常對照組(0.2ml PBS)；感染B組：弓形蟲感染B組(B1組腹腔注射經(jīng)胰酶消化后的弓形蟲速殖子2.5×10<'3>個/只，B2組注射5×10<'3>個/只，B3組注射1×10<'4>個/只、B4組注射2×10<'

5、4>個/只)：陽性C組：環(huán)磷酰胺陽性對照組(40 mg/kg)。攻蟲后第6天，摘取小鼠睪丸，去除表面組織及血跡，一側(cè)睪丸制備睪丸單細(xì)胞懸液， 70％冰乙醇固定，次日PI染色、流式細(xì)胞儀檢測；另一側(cè)睪丸梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片(5μm)，HE染色、病理觀察以及SP法檢測睪丸內(nèi)Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)。 (3)放射免疫法檢測弓形蟲感染后雄鼠血清T、LH及睪丸組織內(nèi)T的水平，免疫組化sABC法檢測激素受體(LHR、AR)的變化

6、：實驗鼠分組同前。攻蟲后第6天，頸椎脫臼法處死小鼠，摘眼球采血，取血清，-20℃保存，用于測定小鼠血清T、LH；睪丸制備勻漿后，4℃、8000轉(zhuǎn)/min、離心15min，取上清，-20℃保存，用于測定睪丸組織內(nèi)T的水平；睪丸組織梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片(5μm)，sABC法測定睪丸內(nèi)激素受體(LHR、AR)的變化。 研究結(jié)果： (1)相對于正常A組，弓形蟲感染組(B1-4)和陽性C組小鼠的體重略減輕，但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析無

7、顯著性差異(P>0.05)。B1-4組及陽性C組小鼠的睪丸臟器系數(shù)與正常A組相比明顯減小(P<0.05)，但附睪臟器系數(shù)無顯著變化(P>0.05)。B1-4組和陽性C組小鼠的生精小管內(nèi)精子數(shù)量減少，與正常A組相比差異顯著(P<0.05)；附睪精子計數(shù)和畸形率與正常A組相比均無顯著性差異(P>0.05)。B1-4組小鼠的睪丸病理切片可見生精小管細(xì)胞層次混亂、細(xì)胞間隙增大、細(xì)胞核凝聚：管腔內(nèi)有細(xì)胞碎片，精子減少甚至缺失，呈生精減少或停滯。

8、 (2)流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)弓形蟲感染組(B1-4)和陽性C組小鼠的睪丸細(xì)胞均存在明顯的細(xì)胞凋亡。其中以二倍體細(xì)胞凋亡尤為明顯，四倍體細(xì)胞數(shù)量亦顯著減少，與正常A相比差異顯著(P<0.01)，單倍體相對變化較?。好庖呓M化檢測：Bcl-2蛋白在B1-4組小鼠睪丸的間質(zhì)和生精小管內(nèi)的表達(dá)變化與正常A組相比無顯著性差異(P>0.05)。Bax在B1-4組小鼠的生精小管表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)，主要集中在精母細(xì)胞層，在精原細(xì)胞、精子細(xì)胞

9、、睪丸間質(zhì)Bax蛋白的變化不明顯。 (3)弓形蟲感染組(B1-4)小鼠的血清LH水平與正常A組相比略有降低，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析無顯著性差異(P>0.05)，其中B1組小鼠的血清LH水平最低，隨著攻蟲劑量增加，LH水平有輕微上升趨勢：陽性C組小鼠的LH水平與正常A組相比略有升高，亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；B1-4組和陽性C組小鼠的血清T水平均有明顯降低，睪丸組織內(nèi)T水平的降低更為明顯，與正常A組相比差異顯著(P<0.01)；LH受

10、體表達(dá)在各組間(A，B1-4，C)無顯著性差異(P>0.05)，而AR在精母細(xì)胞層表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)。 研究結(jié)論： 1.弓形蟲急性感染小鼠模型適用于探討弓形蟲對睪丸生精細(xì)胞及體細(xì)胞的損傷機(jī)制，不適用于弓形蟲對成熟精子形態(tài)及其功能影響的研究。 2.弓形蟲急性感染致生殖障礙的原因可能是損傷了生精器官-睪丸，致使精子生成障礙、出現(xiàn)少精、無精，最終導(dǎo)致雄性的生育力下降。 3.弓形蟲急性感染引起的睪丸損傷

11、以生精細(xì)胞凋亡為主：凋亡對單倍體細(xì)胞(精子細(xì)胞)的影響較?。粚Χ扼w細(xì)胞(次級精母細(xì)胞)影響明顯，同時可導(dǎo)致四倍體細(xì)胞(初級精母細(xì)胞)數(shù)量減少。Bax蛋白在精母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增高明顯，但生精細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞內(nèi)。Bcl-2蛋白的表達(dá)無明顯改變，說明生精細(xì)胞凋亡可能與Bax蛋白的表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。 4.弓形蟲急性感染可致雄鼠血清睪酮(T)、睪丸組織內(nèi)T水平降低，并影響到LH的負(fù)反饋作用和間質(zhì)細(xì)胞T的合成。 5.弓形蟲急性感染