兩株豬源剛地弓形蟲(chóng)的分離及其生物學(xué)特性的研究.pdf

1、剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)是一種細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，在分類(lèi)上隸屬項(xiàng)復(fù)門(mén)(Apicomplexa)、孢子蟲(chóng)綱(Sporozoasida)、真球蟲(chóng)目(Eucoccidia)、弓形蟲(chóng)科(Toxoplasmatidae)、弓形蟲(chóng)屬(Toxoplasma)。弓形蟲(chóng)呈世界性分布，人和200多種動(dòng)物都可感染，貓是終末宿主，人及其它動(dòng)物均為中間宿主。弓形蟲(chóng)病對(duì)人畜的危害很大，孕婦感染弓形蟲(chóng)后導(dǎo)致早產(chǎn)、流產(chǎn)、胎兒發(fā)育畸形，是當(dāng)今致畸胎的四

2、大原因之一，也是免疫功能低下患者(如AIDS病人等)死亡的主要原因。動(dòng)物感染很普遍，多數(shù)呈隱性感染，但豬可大批發(fā)病，死亡率高，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 弓形蟲(chóng)的傳播途徑包括先天性感染和獲得性感染。人類(lèi)的感染多數(shù)為獲得性感染，因生食含包囊的肉制品所致。豬肉是我國(guó)居民普遍喜食的肉品，養(yǎng)豬業(yè)是我國(guó)畜牧業(yè)中的支柱產(chǎn)業(yè)。受弓形蟲(chóng)感染的豬肉可能是人體弓形蟲(chóng)病的一個(gè)重要傳染源。因此，開(kāi)展對(duì)豬源弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株的研究不僅有助于對(duì)豬弓形蟲(chóng)病流

3、行特征的了解以及診斷與防治，也有助于掌握弓形蟲(chóng)的傳播規(guī)律，從而制定公共衛(wèi)生策略。為此，本文開(kāi)展了以下研究。
　　 1、弓形蟲(chóng)PCR檢測(cè)方法的建立
　　 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株RH株經(jīng)腹腔接種ICR小鼠，3～5d后采集小鼠腹水，經(jīng)CF-11纖維素柱純化速殖子，提取蟲(chóng)體DNA。以B1基因和529bp重復(fù)片段序列做為靶點(diǎn)基因，分別進(jìn)行了單基因和雙基因PCR擴(kuò)增，并優(yōu)化PCR反應(yīng)體系。結(jié)果表明529重復(fù)片段比B1基因的敏感性高10倍，前者相

4、當(dāng)于可檢測(cè)0.9個(gè)速殖子，后者可檢測(cè)9個(gè)速殖子;雙重PCR可檢測(cè)到約90個(gè)速殖子。
　　 2、豬源弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株的分離
　　 對(duì)臨床上出現(xiàn)高溫、呼吸困難等癥狀以及剖檢在肝臟、肺臟、淋巴結(jié)、腸道等有出血、壞死等病變的獸醫(yī)院門(mén)診病豬進(jìn)行了弓形蟲(chóng)檢測(cè)。從25例病死豬中檢出5例陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)20％。對(duì)檢測(cè)為陽(yáng)性的病死豬取臟器組織用ICR小鼠傳代，進(jìn)行蟲(chóng)體分離。取死亡小鼠腹水染色鏡檢，可見(jiàn)較多月牙形、半月形或橢圓形的蟲(chóng)體，還可見(jiàn)假包囊

5、。成功分離出2株蟲(chóng)體，分離成功率為40％。兩株分離株分別命名為YZ-1(家養(yǎng)野豬)和YZ-2(商品豬)。
　　 3、兩株豬源剛地弓形蟲(chóng)的鼠毒力分析
　　 將2株分離株在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代，且傳代時(shí)每次經(jīng)腹腔接種的蟲(chóng)體數(shù)相同，直至蟲(chóng)體在小鼠穩(wěn)定寄生。以RH株為參考株，每個(gè)蟲(chóng)株各設(shè)5個(gè)劑量組，分別經(jīng)腹腔接種梯度稀釋的速殖子。結(jié)果表明分離的2株豬源弓形蟲(chóng)分離株對(duì)小鼠的毒力與RH株相同，經(jīng)腹腔接種10個(gè)速殖子致小鼠100％的死亡，

6、且死亡發(fā)生規(guī)律與RH株相似，因此將這2株豬源弓形蟲(chóng)分離株鑒定為鼠毒力株。但2株豬源弓形蟲(chóng)分離株GRA6基因的克隆與序列分析顯示，GRA6基因序列中同時(shí)存在15bp和3bp片段的缺失，與鼠弱毒株(BEVERLEY)的完全一致。
　　 4、兩株豬源剛地弓形蟲(chóng)的基因型分析
　　 采用PCR-RFLP方法，以GRA6，PK1，AG2，c29-2，AG3，BTUB，c22-8，L358，Apico等9個(gè)常用分型基因位點(diǎn)對(duì)兩株豬源弓

7、形蟲(chóng)分離株進(jìn)行基因型分析，結(jié)果顯示，分離的兩株豬源弓形蟲(chóng)的基因型完全一致，為非經(jīng)典型(atypical)，與報(bào)道的中國(guó)貓?jiān)粗曛蠧hinesel基因型完全一致。另外，兩株豬源弓形蟲(chóng)分離株在PK1、GRA6和SAG2三個(gè)基因位點(diǎn)上的基因型均為Ⅱ型，且在進(jìn)化樹(shù)分析中也顯示與基因Ⅱ型聚合在一個(gè)分支。
　　 5、兩株豬源剛地弓形蟲(chóng)的ITS區(qū)序列分析
　　 對(duì)兩株豬源弓形蟲(chóng)分離株的ITS及5.8S基因進(jìn)行了克隆及序列分析，并與Gen