Nogo66蛋白眼用疫苗對大鼠高眼壓和視神經損傷的免疫保護作用及機制研究.pdf

1、視網膜神經節(jié)細胞(retinal ganglial cells,RGCs)損傷后再生困難,這是青光眼、視神經損傷等眼部疾病致盲的主要原因。目前認為,RGCs受損后存活或再生困難的一個主要原因是由于髓磷脂蛋白的存在,抑制因子Nogo是其中重要成員之一。Nogo在正常中樞神經系統(tǒng)(central nervous system,CNS)有少量表達,中樞神經受損后Nogo因子釋放增加、表達增強,不僅抑制神經纖維再生,而且可啟動神經元凋亡過程,導

2、致神經元死亡。Nogo有66個氨基酸殘基在胞膜外形成的拓撲結構,即Nogo66,是Nogo的活性區(qū)域,介導了Nogo的中樞神經再生抑制活性。目前多項研究表明,用主動免疫或被動免疫阻遏髓磷脂或Nogo均可誘導CNS損傷動物產生自身免疫保護反應,減少損傷后變性,促進CNS神經元再生。其機制尚不明確。
　　 在前期工作中,我們原核表達純化了Nogo66蛋白,制備了Nogo66蛋白福氏佐劑疫苗,發(fā)現Nogo66蛋白疫苗可誘導動物機體產生

3、較高滴度抗原特異性IgG抗體,刺激脾T淋巴細胞活化增殖,并可促進慢性高眼壓大鼠視網膜神經節(jié)細胞(RGCs)存活、損傷后的再生修復,減少視神經纖維進一步損害、使神經功能得到一定保護。證實了Nogo66蛋白疫苗具有免疫原性和視神經損傷后的保護和修復作用。
　　 然而,青光眼和視神經損傷是需要長期治療的疾病,Nogo66蛋白疫苗接種后產生的免疫效應持續(xù)時間較短,需要不斷加強免疫才能維持一定的抗體滴度和活化T細胞數量,長期高頻率地通過外

4、周皮下注射接種疫苗的方式顯然很難保證患者的依從性,治療效果可想而知;另外,Nogo66是一個分子量為7.53461kD的小分子蛋白,小劑量皮下接種很難激活機體免疫系統(tǒng),要獲得較好的免疫效應,需要增加劑量,則有致實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的風險。因此,必須改變接種途徑,減少疫苗中蛋白的使用劑量,減少接種頻率,使這種神經免疫保護的治療方法得以實現。<

5、br>　　 眼瞼結膜血管分布密集,血液供應非常豐富,有淺層和深層2個網狀淋巴系統(tǒng),在下眼瞼結膜皺褶中存在重要的局部淋巴組織,研究證實結膜的淋巴組織具有攝取粘膜表面多種抗原進行識別,并作出反應的功能,是一個理想的疫苗接種途徑。從上世紀60年代開始,經結膜接種疫苗途徑就已經在家養(yǎng)動物中廣泛應用。
　　 殼聚糖(chitosan,CS)廣泛存在于自然界,具有無毒、良好的生物相容性、低免疫排斥反應等一系列特殊的化學和生物特性。且其本身

6、具有免疫刺激活性,并可增強藥物滲透和吸收,是一種具有很大潛力的粘膜免疫緩釋材料和免疫佐劑。
　　 本課題在探討Nogo66蛋白疫苗對視網膜視神經損傷的免疫保護作用機制的基礎上,改進Nogo66蛋白疫苗的佐劑和接種途徑,制各一種滴眼液形式的Nogo66蛋白疫苗,并研究其理化性質、免疫性質和神經保護作用機制。
　　 主要研究內容包括以下7部分:
　　 1.不同濃度Nogo66蛋白疫苗對大鼠免疫系統(tǒng)的影響和大鼠免疫狀況

7、評估。在正常SD大鼠接種不同濃度的Nogo66蛋白疫苗,檢測接種后不同時間點血清IgG抗體滴度和脾T細胞增殖率,主要臟器病理檢查并進行EAE狀態(tài)評價。
　　 2.Nogo66蛋白疫苗誘導大鼠機體產生的免疫效應。以最佳疫苗接種劑量接種正常SD大鼠后,檢測大鼠血清IgG抗體滴度和脾分泌Th1類細胞因子IL-2、IFN-γ,和Th2類細胞因子IL-4的情況。
　　 3.建立慢性高眼壓大鼠模型和視神經鉗夾傷大鼠模型,通過檢測眼壓

8、、熒光金逆行染色視網膜神經節(jié)細胞計數,和視網膜血管滲透率檢測對兩種視網膜視神經損傷模型進行鑒定。
　　 4.制備Nogo66蛋白眼用疫苗并進行質量控制。以殼聚糖為佐劑制備滴眼液形式的Nogo66蛋白疫苗,檢測其性狀、pH值、滲透壓、黏度值、含量和穩(wěn)定性。
　　 5.檢測Nogo66蛋白眼用疫苗的安全性。按照眼刺激性試驗標準,進行Nogo66-CS疫苗眼刺激性評分,HE染色法檢測Nogo66-CS疫苗對大鼠視網膜、心、腦、

9、睪丸等主要器官的病理損害,觀察Nogo66-CS疫苗的安全性。
　　 6.Nogo66蛋白眼用疫苗的免疫原性研究。體外培養(yǎng)小膠質細胞,免疫組化法Nogo66-CS疫苗對小膠質細胞CD11b表達的影響;Nogo66-CS疫苗行正常大鼠結膜接種,檢測大鼠淚液及血清中IgG抗體滴度,檢測大鼠結膜組織抗原特異性IgG型漿細胞增生和淋巴細胞浸潤;免疫組化法檢測大鼠視網膜CD11b、MHC-Ⅱ、INOS、TNF-α表達,觀察:Nogo66蛋

10、白眼用疫苗免疫原性。
　　 7.探討Nogo66蛋白眼用疫苗對大鼠視網膜視神經損傷的保護作用及其機制。給予慢性高眼壓模型大鼠和視神經鉗夾傷模型大鼠行結膜接種Nogo66蛋白眼用疫苗,0,21,35天各接種1次。49天時熒光金逆行標記視網膜神經節(jié)細胞并進行計數,免疫熒光法、免疫組化法檢測視網膜GAP43、CD3、BDNF和GDNF表達,免疫印記法檢測視網膜BDNF、GDNF表達,探討Nogo66蛋白眼用疫苗對視網膜視神經損傷免疫保

11、護作用及其機制。
　　 主要結果及結論如下:
　　 1.接種不同濃度Nogo66蛋白疫苗后均可誘導大鼠血清IgG抗體滴度增高和T細胞增殖,其中200μg組IgG抗體滴度和T細胞增殖顯著高于其他實驗組(P＜0.05)。所有實驗大鼠未發(fā)現任何類似實驗性自身免疫性腦脊髓炎的行為變化,且各器官病理檢查未見明顯異常。提示200μg/300μl可最佳程度誘導大鼠免疫反應。
　　 2.Nogo66蛋白疫苗組大鼠脾細胞培養(yǎng)上清I

12、L-2、IFN-γ、IL-4水平均增加,明顯高于對照組。其中Th1類細胞因子IL-2、IFN-γ增高的幅度顯著大于Th2類細胞因子IL-4增高幅度。提示Nogo66疫苗誘導的免疫反應以Th1細胞免疫,即T淋巴細胞介導的免疫效應為主。
　　 3.慢性高眼壓大鼠造模后第3天眼壓開始升高,此后持續(xù)緩慢升高,1周時眼壓為(21.5±3.7)mmHg,與對照組存在顯著差異(P＜0.05)。第4周時達最高峰,為(24.8±3.2)mmHg;

13、到12周時眼壓未見明顯下降,與對照組眼壓仍存在顯著差異。熒光金逆行染色RGCs發(fā)現,高眼壓后1m至3m時SD大鼠RGCs視網膜上RGCs密度持續(xù)降低、數量持續(xù)減少,與相同時間正常對照組比較均差異顯著;視神經鉗央傷后1m時SD大鼠RGCs密度降低、數量顯著減少,與正常對照呈顯著性差異,3m時SD大鼠RGCs數量與1m時比較未見顯著差異。慢性高眼壓損傷后1、4、8周時熒光顯微鏡下觀察視網膜內未見明顯伊文思藍滲透,視網膜滲透率較對照組無顯著差

14、異。視神經鉗夾傷后1天視網膜內可見明顯的藍色熒光,且逐漸減弱。視網膜通透性較對照組均增強,存在顯著差異。提示本實驗建立的慢性高眼壓和視神經鉗央傷模型符合疾病特點,RGCs呈特征性數量減少;慢性高眼壓尚不能破壞大鼠血視網膜屏障。視神經鉗央傷早期即能引起血視網膜破壞,視網膜血管滲透性增強,血視網膜屏障的這種損傷狀態(tài)可持續(xù)至少1個月。
　　 4.制備了Nogo66-CS眼用疫苗,經檢測,其性狀、pH值、滲透壓、黏度、含量及穩(wěn)定性均符合

15、滴眼液制劑的藥劑學要求,提示以殼聚糖為佐劑的Nogo66蛋白疫苗具有良好的理化性質。
　　 5.眼刺激性試驗顯示,點藥當時和點藥后1h、24h、48h、72h、4d、7d,Nogo66-CS疫苗組和生理鹽水組大鼠眼刺激性反應評分均＜3,裂隙燈下檢查眼前節(jié)無異常,且角膜熒光素鈉染色陰性,認為Nogo66-CS眼用疫苗和生理鹽水對眼均無刺激性。于第一次點藥后第16周行眼球視網膜、心、肝、腎、肺、腦、睪丸病理檢查未見明顯異常。提示No

16、go66-CS疫苗無刺激性,對機體是安全的。
　　 6.Nogo66蛋白眼用疫苗具有免疫原性。體外培養(yǎng)的小膠質細胞,在Nogo66-CS疫苗或Nogo66蛋白刺激后表達大量CD11b,細胞活化:CS刺激后表達少量CD11b,細胞靜止;空白組未見CD11b表達。結膜HE染色顯示Nogo66-CS組大鼠結膜組織內有大量淋巴細胞浸澗和IgG型陽性漿細胞增生;Nog066組結膜組織可見少量淋巴細胞浸潤和IgG型陽性漿細胞;CS組結膜僅偶

17、見淋巴細胞浸潤,未見IgG型陽性漿細胞存在。接種疫苗后,Nogo66-CS組淚液IgG抗體滴度從第20天開始持續(xù)增高,與對照組有顯著差異,血清IgG抗體滴度第34天開始增高,幅度較低;Nogo66組和CS組淚液和血清中IgG抗體滴度無顯著變化。Nogo66-CS組視網膜各層小膠質細胞活化,表達CD11b和少量MHC-Ⅱ,未見明顯iNOS、TNF-α表達;CS組視網膜僅少量CD11b表達,未見iNOS、TNF-α表達。提示Nogo66-C

18、S疫苗可激活粘膜免疫和系統(tǒng)免疫,并誘導視網膜小膠質細胞活化,具有較強的免疫原性。
　　 7.Nogo66蛋白眼用疫苗可促進視網膜視神經損傷后RGCs的存活和再生。慢性高眼壓模型大鼠和視神經鉗夾傷模型大鼠Nogo66-CS組RGCs數量顯著高于CS組和未接種組;Nogo66-CS組視網膜有大量GAP43,表明視網膜神經元再生活躍。表明Nogo66蛋白眼用疫苗對受損的視網膜視神經具有保護作用。
　　 8、Nogo66蛋白眼用