內(nèi)皮祖細(xì)胞在高眼壓視神經(jīng)損傷修復(fù)中作用的初步研究.pdf

1、一、急性原發(fā)性閉角型青光眼患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量變化
　　目的：觀(guān)察急性原發(fā)性閉角型青光眼(acute primary angle-closureglaucoma，APACG)患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)數(shù)量的變化規(guī)律，探討EPCs在APACG患者眼壓升高導(dǎo)致視神經(jīng)損傷中的作用。
　　方法：采用隊(duì)列研究設(shè)計(jì)，試驗(yàn)為前瞻性研究。選取天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院眼科確診的AP

2、ACG患者30例為APACG組，健康體檢者20例為正常對(duì)照組。所有入選者取外周靜脈血2 ml，經(jīng)反復(fù)離心過(guò)濾后，通過(guò)流式細(xì)胞儀鑒定EPCs，觀(guān)察APACG患者外周血EPCs數(shù)量的變化，并對(duì)其相關(guān)影響因素(視神經(jīng)損害程度、經(jīng)藥物治療后眼壓、空腹血糖、血脂、青光眼病程及有無(wú)心血管疾病)進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：兩組患者間性別、年齡、血管危險(xiǎn)因素、血液生化指標(biāo)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，APACG組患者眼壓明顯高于正常對(duì)照組，差異

3、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。外周血EPCs為CD34、CD133雙陽(yáng)性反應(yīng)，APACG組及正常對(duì)照組外周血EPCs數(shù)量分別為(48±22)個(gè)/ml和(65±20)個(gè)/ml，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)。1期與3期視神經(jīng)損害者外周血EPCs數(shù)量分別為(60±19)個(gè)/ml和(34±7)個(gè)/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.015，P=0.002)。APACG組患者外周血EPCs數(shù)量與藥物治療后的平均眼壓在一定范圍內(nèi)呈負(fù)相關(guān)

4、(r=-0.835，P<0.05)，與空腹血糖水平、血脂水平、青光眼病程間均無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.343，P=0.227；r=-0.203，P=0.419；r=0.198，P=0.610)。APACG組有心血管疾病與無(wú)心血管疾病患者間外周血EPCs計(jì)數(shù)分別為(56±22)個(gè)/ml和(35±15)個(gè)/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)。
　　結(jié)論：APACG患者外周血EPCs數(shù)量較正常人明顯減少，提示青光眼發(fā)生發(fā)展的病理因素對(duì)

5、外周血EPCs數(shù)量有一定影響。
　　二、大鼠高眼壓模型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡及外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量的變化
　　目的：觀(guān)察大鼠高眼壓模型外周血EPCs數(shù)量及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Retinalganglion cells，RGCs)凋亡的變化，探索EPCs在高眼壓視神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用。
　　方法：采用多波長(zhǎng)激光532nm綠光光凝角鞏膜緣靜脈和上鞏膜靜脈的方法建立大鼠高眼壓模型，單眼造模。將100只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組20只

6、、激光對(duì)照組(眼壓正常)30只和高眼壓模型組50只。對(duì)正常對(duì)照組20只、激光對(duì)照組制備成功后3天、7天、3周時(shí)(每組10只大鼠)及高眼壓模型組大鼠在造模成功后3天、7天、3周、2月、3月時(shí)(每組10只大鼠)先行內(nèi)眥靜脈取血1.5ml，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定外周血EPCs數(shù)量，再處死大鼠，取眼球行病理切片視網(wǎng)膜HE染色、末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法)檢測(cè)RGCs凋亡以及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Bc1-2和Bax表

7、達(dá)。
　　結(jié)果：
　　(1)造模前測(cè)量全部大鼠的平均眼壓為9.9±1.2mmHg，多波長(zhǎng)激光532nm綠光光凝大鼠角鞏膜緣靜脈和上鞏膜靜脈后眼壓馬上開(kāi)始升高，造模后3天眼壓達(dá)到高峰，為37.4±1.5mmHg，而后逐漸緩慢下降，3月末仍高于正常8mmHg以上。造模成功率100％。
　　(2)正常對(duì)照組大鼠外周血EPCs數(shù)量平均為(62.1±13.1)個(gè)/ml，眼壓升高3天時(shí)外周血EPCs數(shù)量到達(dá)高峰，為(121.34±

8、22.4)個(gè)/ml，以后開(kāi)始下降，7天時(shí)為(81.34±23.7)個(gè)/ml，至3周末達(dá)到最低，為(46.1±15.8)個(gè)/ml，而后緩慢升高，2月、3月時(shí)分別為(54.4±19.1)、(54.7±15.9)個(gè)/ml，有低于正常值的趨勢(shì)，經(jīng)單因素方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=23.98，P<0.001)。
　　(3)大鼠高眼壓模型組視網(wǎng)膜HE染色和正常對(duì)照組相比，眼壓升高3天、7天、3周大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)未見(jiàn)明顯差異；高眼壓2月時(shí)，視網(wǎng)膜各

9、層明顯變薄，以外核層最為顯著，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量顯著減少；高眼壓3月時(shí)可見(jiàn)視網(wǎng)膜變薄進(jìn)一步加重，外核層更薄，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量更少，排列更加紊亂。
　　(4)大鼠高眼壓模型組Bax免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞比例和正常對(duì)照組相比，高眼壓3天、7天未見(jiàn)明顯差異，高眼壓3周、2月、3月陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯增高；Bc1-2免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞比例和正常對(duì)照組相比，高眼壓3天、7天、3周未見(jiàn)明顯差異，高眼壓2月、3月陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯增高；大鼠高眼壓模型組視網(wǎng)膜TUN

10、EL陽(yáng)性細(xì)胞比例隨病程逐漸增高。
　　結(jié)論：成功制備出大鼠高眼壓模型；證實(shí)眼壓升高對(duì)外周血EPCs數(shù)量存在時(shí)間依賴(lài)性的影響；隨眼壓升高時(shí)間延長(zhǎng)，視網(wǎng)膜病變逐漸加重，視網(wǎng)膜感光細(xì)胞數(shù)量逐漸減少；視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞逐漸增多，凋亡細(xì)胞分布于RCGs層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外核層。提示EPCs在眼壓升高導(dǎo)致RGCs凋亡、視神經(jīng)損傷的過(guò)程中可能發(fā)揮某種作用。
　　三、大鼠高眼壓模型視網(wǎng)膜HIF-1α、外周血VEGF-A、SDF-1、NO、E

11、T-1的變化及其與EPCs的關(guān)系
　　目的：觀(guān)察大鼠高眼壓模型視網(wǎng)膜缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-induciblefactor-1α，HIF-1α)的表達(dá)，外周血血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A(Vascular endothelialgrowth factor-A，VEGF-A)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1α，SDF-1)、一氧化氮(Nitric oxide，NO)、內(nèi)皮素-1(

12、Endothelin-1，ET-1)的變化及其與EPCs數(shù)量變化的關(guān)系，探討HIF-1α、VEGF-A、SDF-1對(duì)EPCs動(dòng)員、招募的影響以及EPCs對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響。
　　方法：將190只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組20只、激光對(duì)照組(眼壓正常)20只和高眼壓模型組150只。正常對(duì)照組10只、激光對(duì)照組10只及高眼壓模型組在造模成功后3天、7天、3周、2月、3月時(shí)(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)20只大鼠)，行股動(dòng)脈放血10ml，離心后取血清，EL

13、ISA技術(shù)檢測(cè)外周血VEGF-A、SDF-1、NO及ET-1水平。正常對(duì)照組10只、激光對(duì)照組10只及高眼壓模型組在造模成功后3天、7天、3周、2月、3月時(shí)(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只大鼠)，脫頸處死大鼠，摘除眼球取視網(wǎng)膜組織，Western blot技術(shù)檢測(cè)視網(wǎng)膜HIF-1α的蛋白水平。
　　結(jié)果：
　　(1)HIF-1α蛋白在正常視網(wǎng)膜中呈低濃度表達(dá)，眼壓升高3天表達(dá)明顯上升，7天時(shí)達(dá)到高峰，隨后有所下降，但仍高于正常對(duì)照組。

14、r>　　(2)正常對(duì)照組、大鼠高眼壓模型3天、7天、3周、2月、3月組外周血VEGF-A為84.89±4.89ng/L，59.24±6.37ng/L，58.36±5.68ng/L，54.98±5.91ng/L，59.99±5.12ng/L，64.78±5.94ng/L。與正常對(duì)照組相比，眼壓升高外周血VEGF-A均明顯降低(P<0.001)。
　　(3)正常對(duì)照組、大鼠高眼壓模型3天、7天、3周、2月、3月組外周血SDF-1為22

15、9.43±11.61pg/ml，218.34±11.33pg/ml，298.51±32.02pg/ml，294.16±11.90 pg/ml，301.10±14.61pg/ml，307.49±20.46pg/ml。與正常對(duì)照組及眼壓升高3天相比，眼壓升高7天、3周、2月、3月外周血SDF-1均明顯升高(P<0.001)。
　　(4)正常對(duì)照組、大鼠高眼壓模型3天、7天、3周、2月、3月組外周血NO為36.74±5.19μmol/L

16、，32.87±4.30μmol/L，45.67±4.48μmol/L，41.29±5.00μmol/L，41.04±5.15μmol/L，41.45±4.82μmol/L。與正常對(duì)照組相比，眼壓升高3天外周血NO顯著降低(P=0.038)，眼壓升高7天、3周、2月、3月外周血NO明顯升高(P<0.05)。
　　(5)正常對(duì)照組、大鼠高眼壓模型3天、7天、3周、2月、3月組外周血ET-1為72.73±6.41ng/L，57.96±4

17、.42ng/L，70.86±12.14ng/L，77.37±9.95ng/L，76.57±5.85ng/L，77.41±7.43ng/L。與正常對(duì)照組相比，眼壓升高3天外周血ET-1顯著降低(P<0.001)。
　　結(jié)論：眼壓升高使視網(wǎng)膜組織缺血、缺氧，HIF-1α表達(dá)升高，促進(jìn)骨髓EPCs的動(dòng)員，外周血VEGF-A水平降低，SDF-1水平升高，進(jìn)而促進(jìn)EPCs向缺血、缺氧的視網(wǎng)膜組織轉(zhuǎn)移，外周血EPCs、NO及ET-1呈時(shí)間依賴(lài)

18、性變化。提示HIF-1α、VEGF-A、SDF-1可能通過(guò)參與EPCs的動(dòng)員和遷移，在高眼壓視神經(jīng)損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮作用，并對(duì)血管內(nèi)皮功能產(chǎn)生影響。
　　四、辛伐他汀對(duì)大鼠高眼壓模型RGCs凋亡、外周血EPCs數(shù)量及視網(wǎng)膜HIF-1α、外周血及視網(wǎng)膜VEGF-A、SDF-1、NO、ET-1的影響
　　目的：觀(guān)察辛伐他汀對(duì)大鼠高眼壓模型眼壓、RGCs凋亡、外周血EPCs數(shù)量及視網(wǎng)膜HIF-1α、外周血及視網(wǎng)膜VEGF-A、SD

19、F-1、NO、ET-1的影響，探索辛伐他汀促進(jìn)EPCs的動(dòng)員在青光眼視神經(jīng)損傷修復(fù)過(guò)程中的作用。
　　方法：將100只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(CON，10只)、高眼壓模型組(OH，30只)、高眼壓辛伐他汀干預(yù)組(SV，30只)和高眼壓生理鹽水組(NS，30只)。高眼壓辛伐他汀干預(yù)組為高眼壓造模成功后，隨機(jī)選取大鼠30只，以20mg/kg辛伐他汀溶于1ml生理鹽水進(jìn)行灌胃。高眼壓生理鹽水組為高眼壓造模成功后，隨機(jī)選取大30只，以1m

20、l/只/天進(jìn)行灌胃。SV組于開(kāi)始藥物干預(yù)后3天、7天、3周檢測(cè)眼壓1次，行內(nèi)眥靜脈取血1.5ml采用流式細(xì)胞儀測(cè)定外周血EPCs數(shù)量，3周時(shí)脫頸處死后取右眼(6眼)進(jìn)行視網(wǎng)膜HE染色、凋亡細(xì)胞檢測(cè)以及免疫組織化學(xué)法Ba1-2、Bax檢測(cè)。NS組于3天、7天、3周檢測(cè)眼壓1次，行內(nèi)眥靜脈取血1.5ml測(cè)定外周血EPCs數(shù)量。
　　將160只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(CON，30只)、高眼壓模型組(OH，50只)、高眼壓辛伐他汀干預(yù)組(

21、SV，50只)和高眼壓生理鹽水組(NS，30只)。CON組10只、OH組20只、SV組20只和NS組10只(共60只)于開(kāi)始藥物干預(yù)后3周行股動(dòng)脈放血10ml，離心后取血清，采用ELISA技術(shù)檢測(cè)外周血VEGF-A、SDF-1、NO及ET-1的水平。CON組10只、OH組10只、SV組10只和NS組10只(共40只)于開(kāi)始藥物干預(yù)后3周脫頸處死動(dòng)物，摘除眼球，采用western blot技術(shù)檢測(cè)視網(wǎng)膜HIF-1α蛋白水平。CON組10只

22、、OH組20只、SV組20只和NS組10只(共60只)于開(kāi)始藥物干預(yù)后3周脫頸處死動(dòng)物，摘除眼球，采用ELISA技術(shù)檢測(cè)視網(wǎng)膜VEGF-A、SDF-1、NO及ET-1的水平。
　　結(jié)果：
　　(1)高眼壓模型組于眼壓升高3天、7天、3周的平均眼壓分別為37.44±1.5mmHg，31.84±4.1mmHg，25.94±2.2mmHg；高眼壓辛伐他汀干預(yù)組3天、7天、3周的平均眼壓分別為38.0±3.7 mmHg，33.9±2

23、.9 mmHg，24.9±3.2mmHg。辛伐他汀對(duì)大鼠眼壓未表現(xiàn)出顯著影響(P>0.05)。
　　(2)高眼壓模型組于眼壓升高后3天、7天、3周外周血EPCs數(shù)量分別為(121.3±22.4)、(81.3±23.7)、(46.1±15.8)個(gè)/ml；高眼壓辛伐他汀干預(yù)組3天、7天、3周外周血EPCs數(shù)量分別為(138.5±41.4)、(77.9±22.0)、(65.0±13.6)個(gè)/ml。服用辛伐他汀3天和3周外周血EPCs均較

24、高眼壓模型組顯著升高(P<0.05)。
　　(3)辛伐他汀干預(yù)組大鼠與高眼壓模型組相比，HE染色視網(wǎng)膜各層形態(tài)稍整齊；Bc1-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)未見(jiàn)明顯差異，Bax陽(yáng)性細(xì)胞比例降低，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯降低。
　　(4)正常對(duì)照組、大鼠高眼壓模型組、高眼壓辛伐他汀干預(yù)組、高眼壓生理鹽水組外周血VEGF-A分別為83.75±4.76ng/L、53.47±5.36ng/L、80.35±8.62ng/L、54.29±5.28ng/

25、L。與高眼壓模型組相比，辛伐他汀干預(yù)組外周血VEGF-A明顯升高(P<0.001)。
　　正常對(duì)照組、大鼠高眼壓模型組、高眼壓辛伐他汀干預(yù)組、高眼壓生理鹽水組視網(wǎng)膜VEGF-A分別為43.43±5.33ng/L、23.54±5.38ng/L、32.83±5.64ng/L、22.60±5.98ng/L。與高眼壓模型組相比，辛伐他汀干預(yù)組視網(wǎng)膜VEGF-A明顯升高(P<0.001)。
　　(5)正常對(duì)照組、大鼠高眼壓模型組、高眼

26、壓辛伐他汀干預(yù)組、高眼壓生理鹽水組外周血SDF-1分別為230.62±11.27pg/ml、296.28±12.14pg/ml、265.74±39.71pg/ml、291.72±12.21pg/ml。與高眼壓模型組相比，辛伐他汀干預(yù)組外周血SDF-1明顯降低(P=0.001)。
　　正常對(duì)照組、大鼠高眼壓模型組、高眼壓辛伐他汀干預(yù)組、高眼壓生理鹽水組 SDF-1分別為227.41±18.38pg/ml、187.72±19.19pg

27、/ml、212.14±23.71pg/ml、185.63±19.26pg/ml。與高眼壓模型組相比，辛伐他汀干預(yù)組視網(wǎng)膜SDF-1明顯升高(P<0.001)。
　　(6)正常對(duì)照組、大鼠高眼壓模型組、高眼壓辛伐他汀干預(yù)組、高眼壓生理鹽水組外周血NO分別為36.26±4.95μmol/L、41.16±4.97μmol/L、44.31±4.14μmol/L、40.94±4.31μmol/L。與高眼壓模型組相比，辛伐他汀干預(yù)組外周血NO

28、明顯升高(P=0.044)。
　　正常對(duì)照組、大鼠高眼壓模型組、高眼壓辛伐他汀干預(yù)組、高眼壓生理鹽水組視網(wǎng)膜NO分別為38.54±3.53μmol/L、32.20±3.74μmol/L、30.52±3.94μmol/L、31.16±3.36μmol/L。與高眼壓模型組相比，辛伐他汀干預(yù)組視網(wǎng)膜NO無(wú)顯著變化(P=0.159)。
　　(7)正常對(duì)照組、大鼠高眼壓模型組、高眼壓辛伐他汀干預(yù)組、高眼壓生理鹽水組外周血ET-1分別為

29、72.68±6.35ng/L、77.84±7.98ng/L、87.62±5.49ng/L、78.13±7.66ng/L。與高眼壓模型組相比，辛伐他汀干預(yù)組外周血ET-1明顯升高(P<0.001)。
　　正常對(duì)照組、大鼠高眼壓模型組、高眼壓辛伐他汀干預(yù)組、高眼壓生理鹽水組視網(wǎng)膜ET-1分別為53.13±2.07ng/L、28.39±3.33ng/L、39.09±4.81ng/L、28.20±2.65ng/L。與高眼壓模型組相比，辛伐