Nogo-66蛋白疫苗接種對(duì)SD大鼠慢性高眼壓青光眼神經(jīng)損傷保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、青光眼是世界上第二大致盲性疾病，其導(dǎo)致視功能損害的病理基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)進(jìn)行性死亡和視神經(jīng)纖維丟失，因此，青光眼所致的神經(jīng)損傷與保護(hù)研究受到廣泛關(guān)注。 高眼壓是青光眼的主要危險(xiǎn)因素，即使去除高眼壓等誘因，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的丟失和視神經(jīng)萎縮仍然繼續(xù)，研究證實(shí)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的選擇性丟失與機(jī)體免疫潛能密切相關(guān)，因此，增強(qiáng)損傷后的保護(hù)性自身免疫反應(yīng)，為防止損傷神經(jīng)元繼發(fā)性死亡和促進(jìn)損傷神經(jīng)元存活的一種有效手段。目前治療

2、性疫苗接種，在青光眼的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷后神經(jīng)保護(hù)的實(shí)驗(yàn)中取得了不錯(cuò)的效果：Schwartz等用Cop-1(一種人工合成的4個(gè)氨基酸的共聚物)肽對(duì)動(dòng)物進(jìn)行疫苗接種，早期可激活T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用，觀察高眼壓后3w能有效地減少高眼壓所致的RGCs丟失。但是，迄今未見高眼壓后較長時(shí)間的RGCs存活情況報(bào)道，由于Cop-1僅為4個(gè)氨基酸的共聚物，是否能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體未見相關(guān)報(bào)道，可見Cop-1對(duì)高眼壓后長期RGCs的保護(hù)作用仍

3、然不明確。 成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)損傷后神經(jīng)元存活或再生困難，其中一個(gè)重要原因是由于Nogo抑制因子的存在，最新的研究表明，Nogo因子不僅抑制神經(jīng)纖維再生，而且Nogo基因表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)神經(jīng)元凋亡和死亡的發(fā)生，拓寬了Nogo的研究領(lǐng)域。Nogo-A、-B、-C的碳端和氮端在膜內(nèi)，而有66個(gè)氨基酸殘基在胞膜外形成拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)——Nogo-66，Nogo-66與NgR(Nogo-66的一種功能性細(xì)胞表面受體)通過特異性的配體受體式結(jié)合，

4、介導(dǎo)了Nogo的中樞神經(jīng)抑制活性。中樞神經(jīng)損傷后Nogo釋放增加、表達(dá)增強(qiáng)，啟動(dòng)神經(jīng)元凋亡過程，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。 根據(jù)上述研究成果，我們認(rèn)為把Nogo-66作為靶點(diǎn)，從而阻遏Nogo因子對(duì)神經(jīng)元的抑制作用，不失為一種較好的策略，如果將Nogo-66蛋白作為抗原，通過增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)性自身免疫反應(yīng)，或刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體阻斷抑制分子，有可能達(dá)到對(duì)慢性青光眼神經(jīng)損傷的保護(hù)目的。 本研究采用pET系統(tǒng)原核表達(dá)Nogo-66

5、蛋白，制備Nogo-66蛋白疫苗對(duì)大鼠進(jìn)行疫苗接種，觀察大鼠慢性青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活率和視功能保護(hù)情況，為青光眼治療提供新的策略，同時(shí)也為研制治療青光眼視神經(jīng)損傷藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本課題進(jìn)行了以下5個(gè)方面的研究：1、采用SP法免疫組織化學(xué)反應(yīng)、免疫熒光組織化學(xué)—激光共聚焦顯微鏡，觀察Nogo-A/B、-C及Nogo-66受體(NgR)在正常成年SD大鼠視網(wǎng)膜、視神經(jīng)等中樞神經(jīng)系統(tǒng)及坐骨神經(jīng)的表達(dá)和分布；2、制作SD大鼠

6、慢性高眼壓青光眼模型，觀察高眼壓后視網(wǎng)膜Nogo-A/B、-C以及視乳頭篩板Nogo-C的表達(dá)變化；了解阻遏Nogo抑制因子的可行性，為下一步研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；3、采用pET系統(tǒng)原核表達(dá)Nogo-66蛋白；4、制備Nogo-66蛋白疫苗，進(jìn)行動(dòng)物疫苗接種，采用MTT法檢測(cè)接種SD大鼠T淋巴細(xì)胞增殖能力、ELISA法檢測(cè)機(jī)體產(chǎn)生Nogo-66抗體滴度；5、通過逆行熒光金(FG)標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)，視神經(jīng)髓鞘甲苯胺藍(lán)染色以及閃

7、光視覺誘發(fā)電位(F-VEP)，觀察Nogo-66蛋白疫苗對(duì)SD大鼠慢性青光眼視神經(jīng)損傷的保護(hù)作用。 主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1、采用SP法免疫組織化學(xué)和免疫熒光組織化學(xué)—激光共聚焦法證實(shí)，Nogo-A、-B、-C在正常成年SD大鼠視網(wǎng)膜組織中表達(dá)陽性；成年大鼠的視網(wǎng)膜、視神經(jīng)等中樞神經(jīng)廣泛表達(dá)NgR，而坐骨神經(jīng)無NgR表達(dá)。提示，視網(wǎng)膜和視神經(jīng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)一樣表達(dá)Nogo和NgR，損傷后不易存活或再生低下的特征與其一致。

8、 2、構(gòu)建SD大鼠慢性高眼壓青光眼模型 (1)采用532-二極管激光行SD大鼠小梁網(wǎng)和鞏膜淺層血管激光光凝，激光模型后3d眼壓緩慢升高，峰值在1m，持續(xù)2m后逐漸下降，6m時(shí)眼壓恢復(fù)正常。提示，該模型眼壓呈輕-中度升高，持續(xù)時(shí)間較長，其過程緩慢，符合慢性青光眼跟壓的特點(diǎn)。(2)用DNA缺口末端原位標(biāo)記法(TUNEL法)證實(shí)，眼壓持續(xù)升高7d、14d，實(shí)驗(yàn)組周邊區(qū)的RGCs凋亡染色明顯增多。提示，高眼壓可導(dǎo)致RGCs凋亡增

9、加。 (3)使用逆行熒光金標(biāo)記RGCs證實(shí)，2m、6m實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜各部位RGCs數(shù)量較相同時(shí)間對(duì)照組均有顯著減少；2m時(shí)，實(shí)驗(yàn)組視神經(jīng)髓鞘甲苯胺藍(lán)染色顯示視神經(jīng)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維密度無明顯變化，F(xiàn)-VEP的LP1值無明顯變化，此時(shí)視神經(jīng)髓鞘功能尚得以維持；6m時(shí)，實(shí)驗(yàn)組視神經(jīng)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維密度較對(duì)照組減少，F(xiàn)-VEP的AP1值和LP1值較對(duì)照組出現(xiàn)明顯改變、LP1值較2m明顯延長。 提示，高眼壓持續(xù)2m以后逐漸下降，到6m即

10、使眼壓恢復(fù)正常，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突損傷仍繼續(xù)進(jìn)行、RGCs數(shù)量持續(xù)減少、視神經(jīng)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維繼續(xù)丟失、傳導(dǎo)功能出現(xiàn)障礙。 (4)正常大鼠視網(wǎng)膜低表達(dá)Nogo蛋白，當(dāng)眼內(nèi)壓升高時(shí)，其Nogo蛋白表達(dá)明顯升高，并持續(xù)1m；眼壓升高后3m，視乳頭篩板區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能活躍，而且有較多的Nogo-C蛋白表達(dá)。提示，高眼壓時(shí)Nogo蛋白表達(dá)增加，Nogo蛋白表達(dá)上調(diào)與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)凋亡發(fā)生和RGCs數(shù)量減少相關(guān)。 3、成

11、功構(gòu)建陽性重組質(zhì)粒pET-46EK/LIC-Nogo-66，并轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，對(duì)Nogo-66蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)和純化。Tricine-PAGE電泳、WesternBlot蛋白免疫印跡、核酸和蛋白質(zhì)N末端檢測(cè)結(jié)果顯示，表達(dá)Nogo-66蛋白成功，高壓液相色譜法(HPLC)檢測(cè)蛋白純度為98.85％±0.46。提示，pET系統(tǒng)原核表達(dá)Nogo-66蛋白具有快速、定向和易于純化等優(yōu)勢(shì)。 4、成功制備Nogo-66蛋

12、白疫苗，并接種SD大鼠，無實(shí)驗(yàn)性腦脊髓炎發(fā)生 (1)用MTT法檢測(cè)接種大鼠T淋巴細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示初次免疫后10d、20d，Nogo-66疫苗組的T淋巴細(xì)胞增殖較正常對(duì)照組明顯增強(qiáng)。提示，Nogo-66疫苗可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖。 (2)用ELISA檢測(cè)血清Nogo-66抗體滴度，證實(shí)初次免疫后20d能刺激抗體IgG產(chǎn)生增加，并持續(xù)55d，與免疫前比較有顯著性差異。提示，Nogo-66疫苗能刺激機(jī)體特異性抗體IgG的生成增

13、加。 5、用逆行熒光金標(biāo)記RGCs證實(shí)，高眼壓后2m，Nogo-66蛋白疫苗接種平均存活率為88.92％±1.67％，較單純模型組提高8.21％±4.14％；6m時(shí)，疫苗接種組平均存活率為86.08％±1.57％，較單純模型組提高9.13％±5.48％；高眼壓后6m，疫苗接種組視神經(jīng)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維單位面積密度明顯增多；閃光視覺誘發(fā)電位(F-VEP)證實(shí)，疫苗接種組AP1較同時(shí)相點(diǎn)單純模型組AP1高、P1峰潛伏期短。提示，Nogo