αA晶體蛋白對(duì)視神經(jīng)損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞和RGCs軸突的作用及機(jī)制研究.pdf

1、由外傷、缺血、青光眼等導(dǎo)致的急性視神經(jīng)損傷(optic nerve injury)是眼科常見的損傷類型，約占顱腦外傷的2％～5％，也是神經(jīng)性致盲重要原因之一，迄今仍缺乏有效的治療手段。視神經(jīng)損傷修復(fù)與再生途徑及其機(jī)制研究已成為當(dāng)前神經(jīng)科學(xué)的熱點(diǎn)，也是眼科臨床迫切需要解決的問題。視神經(jīng)損傷后難以再生，其原因有神經(jīng)損傷后Caspase-3、RhoA/Rock、Nogo-A等凋亡信號(hào)的激活以及去靶細(xì)胞提供的營養(yǎng)物質(zhì)丟失導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(r

2、etinal ganglion cells，RGCs)繼發(fā)性凋亡，視網(wǎng)膜和視神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生形成膠質(zhì)瘢痕使RGCs軸突難以穿透。另外，反應(yīng)性增生的膠質(zhì)細(xì)胞還會(huì)釋放一些細(xì)胞外基質(zhì)成分如硫酸軟骨素酸性糖蛋白(CSPGs)形成抑制微環(huán)境，進(jìn)一步抑制軸突再生和延長。
　　促進(jìn)RGCs軸突再生的主要辦法有補(bǔ)充外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子如腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)、睫狀神經(jīng)生長因子(CNTF)、神經(jīng)生長因子(NGF)等，但這些外源性因子的

3、補(bǔ)充只能維持RGCs的短暫存活，對(duì)軸突的再生作用效果較小;干擾凋亡信號(hào)通路如Caspase、RhoA/Rock、Nogo-A等雖然可以減少RGCs凋亡，但并不能增強(qiáng)軸突再生能力;通過抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活化以減少膠質(zhì)瘢痕的形成和微環(huán)境產(chǎn)生，這雖然有利于軸突的再生，但對(duì)RGCs軸突的存活和再生數(shù)量難以保障。以上各種干預(yù)方法均未能達(dá)到有效促進(jìn)RGCs軸突長距離生長和功能性恢復(fù)的效果。由此可見，視神經(jīng)損傷后軸突的再生的障礙是多環(huán)節(jié)多因素共同作用的結(jié)

4、果，尋找具有多靶點(diǎn)作用的分子及綜合干預(yù)將是研究視神經(jīng)損傷后功能性再生的重要方向之一。
　　α晶體蛋白(alpha crystallin)是小分子熱休克蛋白家族(small heat shock protein，sHsp)的一員，分為A型和B型。已有研究證實(shí)，α晶體蛋白作為應(yīng)激性蛋白在抗炎、抗凋亡、抗蛋白聚集等方面發(fā)揮著重要作用，在視神經(jīng)損傷方面對(duì)RGCs的存活和軸突再生具有非常好的生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在視神經(jīng)橫斷模型中，損傷的晶

5、狀體能刺激RGCs軸突的再生，且生長錐能到達(dá)位于上丘的視皮層.α晶體蛋白能通過RhoA/Rock信號(hào)通路促進(jìn)RGCs的存活和軸突的生長，也能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和炎性因子TNF-α及iNOS的釋放保護(hù)節(jié)細(xì)胞的存活。這些研究提示α晶體蛋白可能是一個(gè)具有多靶點(diǎn)作用的分子。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，αA晶體蛋白和αB晶體蛋白均能夠影響離體培養(yǎng)的腦源性星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和增殖，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)也證實(shí)αA晶體蛋白或αB晶體蛋白處理后，星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移

6、明顯被抑制，但αA晶體蛋白的效果更顯著。但具體原因尚不清楚。
　　BMP/Smad是調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖、分化的關(guān)鍵信號(hào)通路。在脊髓損傷后，BMP2/4/7和pSmad1/5/8在少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)明顯增高。細(xì)胞培養(yǎng)提示，BMP4能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞，當(dāng)給予BMP4抑制劑Noggin后，星形膠質(zhì)細(xì)胞的生成數(shù)量明顯減少。以上研究均證實(shí)BMP/Smad參與星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化、增殖、分化。在體外培養(yǎng)

7、的視乳頭區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧復(fù)氧的刺激后，BMP和BMPR的基因表達(dá)和蛋白水平均明顯增加，星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，同時(shí)可檢測(cè)到α晶狀體蛋白表達(dá)增加，但兩者的相互關(guān)系尚不明確。
　　基于以上研究的背景我們提出如下假設(shè):視神經(jīng)損傷后反應(yīng)性增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活并形成的膠質(zhì)瘢痕和抑制軸突再生的微環(huán)境是軸突難以再生的關(guān)鍵因素。αA晶體蛋白能減輕膠質(zhì)瘢痕的形成和影響抑制微環(huán)境從而促進(jìn)軸突的再生并改善視功能。而且αA晶體蛋白可能是通過BMP/

8、Smad信號(hào)通路而發(fā)揮作用。為此，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，我們建立大鼠視神經(jīng)不完全損傷模型，同時(shí)給予玻璃體腔注射αA晶體蛋白(10-4g/l，4ul)，對(duì)照組給予同等劑量的PBS注射，運(yùn)用IHC和WB技術(shù)觀察術(shù)后1天，3天，5天，14天視網(wǎng)膜和視神經(jīng)GFAP表達(dá)變化，用同樣技術(shù)方法觀察術(shù)后14天TUJ1、GAP-43、CSPGs、Neurocan蛋白的表達(dá)變化，了解αA晶體蛋白對(duì)膠質(zhì)瘢痕形成和軸突再生的影響。離體實(shí)驗(yàn)中，分離培養(yǎng)視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞

9、，通過劃痕實(shí)驗(yàn)、糖氧剝奪(OGD)實(shí)驗(yàn)觀察αA晶體蛋白對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移和激活的影響。通過RT-PCR檢測(cè)BMP/Smad信號(hào)分子的mRNA水平探討αA晶體蛋白影響星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的可能機(jī)制。為αA晶體蛋白下一步研究與運(yùn)用提供更有力理論支撐。
　　本研究包含三個(gè)部分
　　第一部分、SD大鼠視神經(jīng)不完全損傷后RGCs的變化及視網(wǎng)膜和神經(jīng)損傷區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的觀察
　　采用視神經(jīng)輕度夾傷辦法建立視神經(jīng)不完全損傷模型。我們

10、觀察到視神經(jīng)損傷后3天RGCs即發(fā)生明顯的凋亡，損傷后14天RGCs的凋亡接近52％。視網(wǎng)膜和視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活，術(shù)后1天GFAP表達(dá)即明顯增加，于術(shù)后14天時(shí)GFAP的表達(dá)達(dá)到最高水平。在視神經(jīng)損傷區(qū)，星形膠質(zhì)細(xì)胞大量的活化、增殖和遷移進(jìn)入損傷區(qū)形成致密的膠質(zhì)瘢痕。同時(shí)，電生理F-VEP的N1-P1幅值降低（5.24±1.67uV）和P1潛伏期延長（126.75±8.94ms），提示視神經(jīng)損傷后RGCs減少、膠質(zhì)細(xì)胞活化、視功能

11、嚴(yán)重受損。
　　第二部分:玻璃體腔注射αA晶體蛋白對(duì)視神經(jīng)損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和RGCs軸突再生的影響。
　　視神經(jīng)損傷后玻璃體腔注射αA晶體蛋白(10-4g/l，4μl))，對(duì)照組給予同等劑量的PBS注射。我們通過IHC和WB觀察視神經(jīng)損傷區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和GFAP、CSPGs、Neurocan、TUJ1、GAP-43的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn):αA晶體蛋白能明顯抑制視神經(jīng)損傷區(qū)周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和遷移，從而抑制膠質(zhì)瘢痕的

12、形成。引導(dǎo)損傷區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的重排，同時(shí)可以減少軸突再生主要抑制物CSPGs和Neurocan的表達(dá)。通過檢測(cè)TUJ1和GAP-43的水平，發(fā)現(xiàn)αA晶體蛋白能夠有效保護(hù)視神經(jīng)TUJ1陽性突觸的存活，促進(jìn)RGCs軸突的再生并使再生軸突穿過損傷區(qū)。F-VEP檢查發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，αA晶體蛋白能有效改善視神經(jīng)損傷后大鼠F-VEP的N1-P1的幅值（對(duì)照組:5.83±2.64μV治療組:12.02±1.64μv）和P1的潛伏期（對(duì)照組:126

13、±9ms治療組:100±9ms），使部分視神經(jīng)功能恢復(fù)。
　　第三部分:αA晶體蛋白影響視神經(jīng)星形膠質(zhì)增殖的分子機(jī)制研究
　　為進(jìn)一步探討αA晶體蛋白影響視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細(xì)胞的可能分子機(jī)制，我們對(duì)視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)。運(yùn)用差速貼壁法獲得純度較高的視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，運(yùn)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察αA晶體蛋白(10-4g/l)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果顯示αA晶體蛋白能夠抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移。
　　利用糖氧剝奪模型（

14、Oxygen-Glucose Deprivation，OGD）成功模擬視神經(jīng)夾傷后的視神經(jīng)損傷區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。將細(xì)胞分為對(duì)照組、OGD組、OGD+BSA組、OGD+αA晶體蛋白治療組。細(xì)胞免疫熒光(ICC)和WB分析GFAP和Neurocan的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)OGD能刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，使GFAP和Neurocan的水平升高，當(dāng)給予αA晶體蛋白（10-4g/l）處理后，GFAP和Neurocan的水平明顯被抑制，觀察結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

15、結(jié)果相一致。我們通過對(duì)BMP/Smad各節(jié)點(diǎn)信號(hào)分子的基因表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，αA晶體蛋白能抑制BMP2、BMP4及Smad1、Smad8的mRNA表達(dá)。結(jié)果提示，αA晶體蛋白可能通過BMP/Smad信號(hào)通路抑制視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的表達(dá)和Neurocan的分泌。
　　結(jié)論:
　　1.視神經(jīng)損后，一方面由于RGCs失去靶細(xì)胞提供的營養(yǎng)物質(zhì)、凋亡信號(hào)通路的激活發(fā)生繼發(fā)性凋亡，另一方面視神經(jīng)損傷刺激視網(wǎng)膜和視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化

16、形成膠質(zhì)瘢痕，使RGCs軸突難以存活和再生。我們通過αA晶體蛋白玻璃體腔注射治療發(fā)現(xiàn)αA晶體蛋白不僅能保護(hù)RGCs軸突的存活，使部分F-VEP波形恢復(fù)，改善視神經(jīng)傳導(dǎo)功能，還能有效抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和增殖，引導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的重排，減弱膠質(zhì)瘢痕的形成和減少抑制性分子CSPGs、Neurocan的表達(dá)，從而促進(jìn)軸突的再生并使再生軸突穿過損傷區(qū)。這些發(fā)現(xiàn)，證實(shí)αA晶體蛋白是一種具有多靶點(diǎn)作用的分子，對(duì)視神經(jīng)損傷后神經(jīng)修復(fù)的治療具有廣闊的運(yùn)