α-晶體蛋白對(duì)視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、活化、分泌功能的影響研究.pdf

1、一直以來，中樞神經(jīng)損傷后的修復(fù)與再生都是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)以及難點(diǎn)，導(dǎo)致其損傷后難以再生的原因包括兩個(gè)方面：神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)生繼發(fā)性凋亡以及新生軸突難以穿過損傷區(qū)。其中軸突需要穿過膠質(zhì)細(xì)胞活化聚集形成的膠質(zhì)疤痕和損傷時(shí)所產(chǎn)生的抑制性微環(huán)境。膠質(zhì)瘢痕的形成雖然在一定程度上能夠減輕急性炎癥反應(yīng)引起的的神經(jīng)元毒害作用，但是它所形成的機(jī)械屏障阻礙了再生軸突穿過損傷區(qū)域，除了機(jī)械屏障，膠質(zhì)瘢痕還能夠產(chǎn)生一些抑制性因子損傷節(jié)細(xì)胞和再生軸突。中樞神經(jīng)

2、系統(tǒng)損傷后的幾天之內(nèi)會(huì)引發(fā)一系列的細(xì)胞和分子由靜止?fàn)顟B(tài)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)引起膠質(zhì)瘢痕的形成的變化過程，在這些變化中所涉及的主要細(xì)胞類型包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，膠質(zhì)瘢痕的最終結(jié)構(gòu)主要是由星形膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過不斷分裂和遷移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷區(qū)，最終填補(bǔ)空置的空間。多個(gè)學(xué)者針對(duì)于導(dǎo)致中樞神經(jīng)損傷后再生困難的兩大主要原因進(jìn)行了大量研究：外源性補(bǔ)充多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；運(yùn)用多種物質(zhì)干擾凋亡信號(hào)通路用抗體或RNA干擾阻

3、斷髓鞘抑制作用；嘗試移植外周神經(jīng)；干細(xì)胞的修復(fù)。這些方法都能在一定程度上維持節(jié)細(xì)胞的存活，但是卻不能使再生軸突穿過損傷區(qū)形成功能性的連接。經(jīng)過多年的研究，學(xué)者們一致認(rèn)為需要尋找一種多靶點(diǎn)作用物質(zhì)并且同時(shí)滿足兩個(gè)條件1.維持節(jié)細(xì)胞的存活而且能促進(jìn)軸突的再生并使再生軸突穿過膠質(zhì)瘢痕區(qū)建立正確的細(xì)胞軸突之間的功能性聯(lián)系，才是治療中樞神經(jīng)修復(fù)和再生的理想物質(zhì)。Fischer等人在無意間發(fā)現(xiàn)晶狀體和視神經(jīng)同時(shí)損傷時(shí)，可成功促進(jìn)RGCs存活和視神經(jīng)

4、軸突生長(zhǎng)，并且其再生軸突可達(dá)到上丘，形成功能性突觸聯(lián)系，推測(cè)晶狀體損傷后釋放出一類神經(jīng)保護(hù)性物質(zhì)，并且這種物質(zhì)的神經(jīng)保護(hù)作用也正好符合以上兩個(gè)必要條件。經(jīng)分離檢測(cè)該物質(zhì)為α-晶體蛋白。
　　晶體蛋白約占晶狀體蛋白總量的90％，對(duì)維持晶狀體透明和白內(nèi)障發(fā)展起決定因素，其中α-晶體蛋白占蛋白總量的40%，屬于小熱休克蛋白（sHSP）的一員，作為分子伴侶和結(jié)構(gòu)蛋白在細(xì)胞和組織中起支持保護(hù)作用。大量研究證實(shí)α-晶體蛋白不僅存在于晶狀體中，

5、也在大腦、心臟、肝臟等重要器官中被發(fā)現(xiàn)，并發(fā)揮著重要的保護(hù)作用，在視覺系統(tǒng)中，α-晶體蛋白參與調(diào)控多種視網(wǎng)膜相關(guān)疾病，包括視神經(jīng)機(jī)械損傷、缺血損傷、老年性黃斑變性、葡萄膜炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變等；參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，參與Caspase-3抑制凋亡。本實(shí)驗(yàn)小組在前期的研究中也證實(shí)了α-晶體蛋白不僅能夠促進(jìn)節(jié)細(xì)胞的存活和軸突的再生同時(shí)也能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和炎性因子的釋放。這一發(fā)現(xiàn)肯定了α-晶體蛋白在保護(hù)視神經(jīng)的積極作用，但它如何促進(jìn)再生軸突

6、穿過星形膠質(zhì)細(xì)胞為主的膠質(zhì)瘢痕這一屏障有待研究。推測(cè)α-晶體蛋白除了作用于RGCs起保護(hù)作用外也可能對(duì)視神經(jīng)活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞有一定的抑制作用，從而促進(jìn)了再生軸突穿過膠質(zhì)瘢痕。本研究離體分離培養(yǎng)視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，一方面用脂多糖刺激視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞模擬視神經(jīng)損傷時(shí)急性炎性反應(yīng)引起星形膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)，觀察α-晶體蛋白對(duì)活化視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、視神經(jīng)GFAP表達(dá)變化及分泌功能的影響，另一方面運(yùn)用對(duì)視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞劃痕刺激模擬視神

7、經(jīng)機(jī)械損傷時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞的物理活化，觀察α-晶體蛋白對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移和CSPGs表達(dá)和炎性因子分泌功能的影響，探索α-晶體蛋白是否通過作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞來促進(jìn)損傷視神經(jīng)軸突再生。
　　本研究主要分為兩個(gè)部分：
　　1.α-晶體蛋白對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、活化及分泌功能的影響研究
　　2.α-晶體蛋白對(duì)劃痕實(shí)驗(yàn)中視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移、活化及分泌功能的影響研究
　　第一部分α-晶體蛋白對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的

8、視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、活化及分泌功能的影響研究
　　1、分離培養(yǎng)視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞并鑒定其純度；
　　2、利用CCK-8檢測(cè)α-晶體蛋白對(duì)脂多糖（LPS）活化的視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖能力的影響；
　　3、運(yùn)用免疫組化染色和Western blot（WB）免疫組化染色觀察LPS誘導(dǎo)視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞后膠質(zhì)纖維酸性糖蛋白（GFAP）的蛋白水平變化；
　　4、運(yùn)用ELISA檢測(cè)α-晶體蛋白對(duì)LPS誘導(dǎo)視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)

9、胞分泌IL-1β、TNF-α的濃度變化。
　　第二部分α-晶體蛋白對(duì)機(jī)械活化的視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移、分泌功能的影響研究
　　1、通過劃痕實(shí)驗(yàn)觀察α-晶體蛋白對(duì)活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移功能的的影響；
　　2、運(yùn)用免疫組化染色觀察觀察用α-晶體蛋白對(duì)劃痕實(shí)驗(yàn)中星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性糖蛋白（GFAP）和CSPGs變化；
　　3、運(yùn)用ELISA檢測(cè)檢測(cè)α-晶體蛋白對(duì)劃痕實(shí)驗(yàn)中視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α

10、的濃度變化
　　結(jié)果：
　　第一部分α-晶體蛋白對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、活化及分泌功能的影響研究
　　LPS刺激后，星形膠質(zhì)細(xì)胞大量增殖，同時(shí)細(xì)胞突起延長(zhǎng)，相鄰間突起交錯(cuò)聯(lián)系增多，胞體變大，GFAP的熒光強(qiáng)度和蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，給予α-晶體蛋白（10-4g/l）干預(yù)后，與LPS刺激組相比，α-晶體蛋白下調(diào)視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，同時(shí)細(xì)胞免疫熒光提示GFAP的熒光強(qiáng)度明顯減弱，WB提示GFAP的蛋白水平顯

11、著下降，α-晶體蛋白處理后，LPS活化的視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-1β含量相比LPS刺激組存在顯著差異。
　　第二部分α-晶體蛋白對(duì)機(jī)械活化的視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移、分泌功能的影響研究
　　劃痕后，劃痕周邊的星形膠質(zhì)細(xì)胞受到活化，開始增殖和遷移，給予給予α-晶體蛋白（10-4g/l）干預(yù)后，相對(duì)遷移率在24h和48h較空白對(duì)照組都有明顯減小，ICC觀察到給予α-晶體蛋白后，劃痕周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞聚集成團(tuán)細(xì)胞減

12、少，其分泌的抑制性因子CSPGs的表達(dá)減弱。上清液中的TNF-α和IL-1β含量均低于空白對(duì)照組。
　　結(jié)論：分別用 LPS刺激和劃痕刺激模擬視神經(jīng)損后微環(huán)境對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞化學(xué)刺激和機(jī)械刺激活化過程，發(fā)現(xiàn)α-晶體蛋白能有效抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和增殖，減少抑制性分子CSPGs分泌，同時(shí)能夠抑制炎性因子TNF-α和IL-1β的分泌，證實(shí)α-晶體蛋白對(duì)視神經(jīng)損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化有明確的抑制作用，這可能就是α-晶體蛋白能夠促進(jìn)視神經(jīng)