uPA-siRNA重組慢病毒載體感染兔軟骨細(xì)胞對其增殖情況初步研究.pdf

1、目的：構(gòu)建靶向特異尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）-siRNA慢病毒表達(dá)載體后并篩選出高效靶向序列，轉(zhuǎn)染兔軟骨細(xì)胞，觀察其對軟骨細(xì)胞增殖、uPA、MMP-3基因及蛋白表達(dá)水平的影響。
　　方法：取原代生長良好的兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞傳代接種培養(yǎng)，根據(jù)GenBank中兔uPA基因序列，參照siRNA靶點設(shè)計原則，設(shè)計、合成構(gòu)建靶向兔uPA-siRNA序列，利用RT-PCR篩選高效靶向序列，按照不同的感染復(fù)數(shù)（MOI）值加入慢病毒顆粒液，共

2、同培養(yǎng)后確定最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）值，并測定分析病毒感染效率，高效靶向序列經(jīng)慢病毒包裝后，通過Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染兔軟骨細(xì)胞，并按實驗進(jìn)行隨機(jī)分組，分為實驗組（轉(zhuǎn)染uPA-siRNA慢病毒載體組）、空載體組（轉(zhuǎn)染空慢病毒載體組）、空白對照組（未予任何處理組）、藥物對照組（加載MMP特異性抑制劑TIMP）。細(xì)胞離體培養(yǎng)96h后，應(yīng)用實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及蛋白免疫印跡法（Western blot）分

3、別檢測軟骨細(xì)胞uPA-siRNA對細(xì)胞內(nèi)uPA、MMP-3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，并通過CCK-8法檢測uPA-siRNA對軟骨細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染原代軟骨細(xì)胞，通過siRNA載體質(zhì)粒測序與預(yù)期siRNA序列一致，DNA測序序列正確無突變，從中篩選出高效靶向序列（即沉默效果最佳）。轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞培養(yǎng)可見，早期軟骨細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞貼壁生長；傳2代時，細(xì)胞呈現(xiàn)梭形，并聚集生長；傳5代時，細(xì)胞呈現(xiàn)典型纖維

4、細(xì)胞樣；符合軟骨細(xì)胞生長特點，可進(jìn)行后續(xù)實驗。隨著感染復(fù)數(shù)（MOI）的增加，慢病毒的感染效率也隨之增加，當(dāng)感染復(fù)數(shù)(MOI)為100時感染率超過85％，符合后續(xù)實驗要求。通過CCK-8檢測siRNA對軟骨細(xì)胞增殖能力的影響發(fā)現(xiàn)，給予轉(zhuǎn)染uPA-siRNA慢病毒載體后的軟骨細(xì)胞增殖并未受到抑制。實驗組uPA mRNA、MMP-3mRNA及uPA、MMP-3蛋白的表達(dá)水平顯著低于空載體租、空白對照組和藥物對照組（P<0.05），而空載體組、