幽門螺桿菌臨床菌株主要蛋白抗原表達(dá)及其誘導(dǎo)宿主抗體水平差異性的研究.pdf

1、幽門螺桿菌感染與人慢性胃炎、消化道潰瘍和胃腺癌的發(fā)病密切相關(guān)。一些抗生素可有效殺滅感染的幽門螺桿菌，但存在再次感染和誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性等問題。接種疫苗是預(yù)防傳染病最為經(jīng)濟(jì)和有效的方法，但至今尚無幽門螺桿菌疫苗產(chǎn)品。幽門螺桿菌培養(yǎng)條件苛刻、生長(zhǎng)緩慢、產(chǎn)量極低，故基因工程疫苗可能是研發(fā)該菌疫苗唯一可行的途徑。目前最為肯定的幽門螺桿菌蛋白抗原是尿素酶B亞單位(UreB)和幽門螺桿菌黏附素(HpaA)，其次是空泡毒素(VacA)、細(xì)胞毒性相關(guān)蛋

2、白(CagA)、中性粒細(xì)胞激活蛋白(NapA)、鞭毛蛋白A亞單位(FlaA)和B亞單位(FlaB)等。然而，不同國(guó)家和地區(qū)同種細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)基因型和抗原表型可有較大差別。
　　 本研究建立了基于幽門螺桿菌重組蛋白抗原rUreB、rHpaA、rVacA、rCagAl、rNapA、rFlaA和rFlaB及其抗體的ELISAs，檢測(cè)了分離自胃炎或消化道潰瘍病人胃黏膜145株幽門螺桿菌臨床菌株上述抗原的表達(dá)情況，以及145例病人血清中上述抗

3、原的IgG抗體；另采用PCR檢測(cè)了上述幽門螺桿菌臨床菌株中各抗原編碼基因攜帶情況，以期為研制我國(guó)幽門螺桿菌基因工程疫苗的抗原選擇提供較為充分的依據(jù)。實(shí)驗(yàn)采用了332例胃炎、消化道潰瘍病人胃黏膜活檢標(biāo)本和血清標(biāo)本，以及35例健康體檢兒童的血清標(biāo)本。采用選擇性哥倫比亞血瓊脂為分離培養(yǎng)基，通過革蘭染色鏡檢、尿素酶試驗(yàn)和氧化酶試驗(yàn)對(duì)分離的幽門螺桿菌進(jìn)行鑒定。用IPTG誘導(dǎo)rUreB、rHpaA、rVacA、rCagAl、rNapA、rFlaA和

4、rFlaB表達(dá)，Ni-NTA親和層析柱和Westem Bolt分別提純和鑒定目的表達(dá)產(chǎn)物。制備上述7種重組表達(dá)蛋白抗原的兔抗血清，免疫雙擴(kuò)散法檢測(cè)其效價(jià)。用7種重組蛋白為包被抗原，濃度均為2μg/每孔，以病人血清為一抗、HRP標(biāo)記羊抗人IgG為二抗，建立檢測(cè)血清標(biāo)本中上述抗原IgG抗體的ELISAs。用幽門螺桿菌NCTC11637株及臨床分離菌株、10株大腸桿菌和10株金黃色葡萄球菌(陰性對(duì)照)的超聲波破碎物上清為包被抗原，濃度均為5μ

5、g蛋白/每孔，上述7種幽門螺桿菌重組蛋白抗原兔抗血清為一抗、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗，建立檢測(cè)幽門螺桿菌臨床菌株中上述7種抗原的ELISAs。采用PCR檢測(cè)幽門螺桿菌臨床菌株ureB、hpaA、vacA、cagA、napA、flaA和flaB基因，采用瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，332例慢性胃炎或消化性潰瘍病人胃黏膜活檢標(biāo)本中，幽門螺桿菌分離陽性率為43.8％(145/332)。7種重組蛋白抗原表達(dá)

6、量分別約為細(xì)菌總蛋白的15％～56％，提純后經(jīng)SDS-PAGE后均顯示為單一條帶并可與幽門螺桿菌全菌抗體形成陽性雜交結(jié)果。7種重組蛋白抗原兔抗血清的免疫雙擴(kuò)散效價(jià)1:4～1:80100％(145/145)、86.9％(126/145)、42.8％(62/145)、70.3％(102/145)、89.7％(130/145)、84.8％(123/145)和79.3％(115/145)幽門螺桿菌感染病人血清標(biāo)本中分別為UreB、HpaA、Va

7、cA、CagA、NapA、FlaA和FlaB抗體檢測(cè)結(jié)果陽性。所有幽門螺桿菌臨床菌株(100％，145/145)均表達(dá)UreB、HpaA、FlaA和FlaB，52.4％(76/145)、91.7％(133/145)和93.1％(135/145)幽門螺桿菌臨床菌株表達(dá)VacA、CagA和NapA。所有幽門螺桿菌臨床菌株(100％，145/145)areB、hpaA、vacA、flaA和flaB基因PCR結(jié)果陽性，96.6％(140/145

8、)和97.9％(142/145)幽門螺桿菌臨床菌株cagA和napA基因PCR結(jié)果陽性。
　　 研究表明：⑴幽門螺桿菌臨床菌株7種蛋白抗原基因攜帶率和表達(dá)率有明顯差異，ureB、hpaA、flaA、flaB、cagA和napA基因均顯示為高攜帶和高表達(dá)狀況，vacA基因攜帶率為100％但表達(dá)率僅為52.4％。⑵幽門螺桿菌感染的胃炎、消化道潰瘍病人血清中UreB抗體陽性率為100％，與幽門螺桿菌臨床菌株中編碼基因攜帶率和表達(dá)率相符

9、；NapA、HpaA和FlaA抗體陽性率較高(84.8％～89.7％)，但低于幽門螺桿菌臨床菌株中編碼基因攜帶率和表達(dá)率；VacA和CagA抗體陽性率較低(42.8％，70.3％)，與幽門螺桿菌臨床菌株中編碼基因高攜帶率或高表達(dá)率之間的差距很大。⑶綜合上述7種幽門螺桿菌蛋白抗原基因攜帶、表達(dá)及病人血清抗體陽性率檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)考慮各重組蛋白抗原表達(dá)產(chǎn)量差異，我們認(rèn)為首先是rUreB、其次是rNapA和rHpaA較為適用于幽門螺桿菌基因重組