量子點流式微球技術(shù)定量檢測半乳甘露聚糖方法學(xué)建立及初步臨床應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　以曲霉菌細胞壁特殊成分—半乳甘露聚糖（Galactomannan，GM）作為研究對象，構(gòu)建一種便捷、靈敏度高、特異性高、可定量測定曲霉菌半乳甘露聚糖的檢測方法。
　　方法:
　　1.光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡、流式細胞儀對聚苯乙烯微球進行初步觀察。
　　2.酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測聚苯乙烯微球偶聯(lián)抗體能力。
　　3.共價偶聯(lián)法制備生物素化抗體。
　　4.EDAC偶聯(lián)法制備鏈霉親和素化量子點(QDs

2、-SA)。
　　5.聚苯乙烯微球與抗體采用EDAC偶聯(lián)法進行偶聯(lián)，微量BCA蛋白質(zhì)定量法觀察免疫診斷微球穩(wěn)定性。
　　6.量子點流式微球技術(shù)定量檢測血清半乳甘露聚糖方法學(xué)建立，對其精密度、線性范圍、靈敏度、回收率、干擾率、方法學(xué)比對等進行初步評價。
　　7.量子點流式微球技術(shù)定量檢測半乳甘露聚糖方法、國外Platelia Aspergillus試劑盒和國內(nèi)半乳甘露聚糖ELISA試劑盒對臨床血清標本進行檢測，對檢測方法診

3、斷效能進行受試者工作曲線（ROC）分析。
　　8.量子點流式微球技術(shù)定量檢測半乳甘露聚糖方法對臨床血清標本進行檢測;western blot法和全自動免疫熒光定量分析儀mini-VIDAS對臨床血清標本進行降鈣素原檢測。
　　結(jié)果:
　　1.2μm、5μm、10μm聚苯乙烯微球形態(tài)規(guī)則圓潤、粒徑均一性好、無畸形球、無微球碎片、微球分布均勻、無粘黏現(xiàn)象，微球表面孔穴豐富。
　　2.羧基化聚苯乙烯微球偶聯(lián)抗體能力顯著

4、強于未羧基化聚苯乙烯微球，共價偶聯(lián)的抗體生物活性未受明顯影響。
　　3.成功制備鏈霉親和素化量子點與生物素化抗體，生物素化抗體生物活性未受到明顯影響，與鏈霉親和素化量子點可發(fā)生特異性結(jié)合。
　　4.鼠抗半乳甘露聚糖抗體最佳偶聯(lián)濃度為100μg/mL;鏈霉親和素化量子點最佳使用濃度為20nmol/L;生物素化抗體最佳使用濃度為8μg/L;最佳偶聯(lián)時間為2h;免疫診斷微球儲存于4℃環(huán)境中可維持65d穩(wěn)定性。
　　5.量子點

5、流式微球技術(shù)定量檢測半乳甘露聚糖方法線性范圍、靈敏度、變異系數(shù)優(yōu)于國內(nèi)半乳甘露聚糖ELISA試劑盒;本方法回收率為97.57％-104.96％，總平均回收率為100.76％;50μg/mL-200μg/mL膽紅素對本方法檢測結(jié)果無明顯影響;兩種方法檢測結(jié)果相關(guān)性較好。
　　6.量子點流式微球技術(shù)定量檢測半乳甘露聚糖方法診斷效能優(yōu)于國內(nèi)半乳甘露聚糖ELISA試劑盒;本方法與國際公認商品化Platelia Aspergillus試劑盒

6、診斷效能相近;兩種方法檢測半乳甘露聚糖陽性率無顯著性差異。
　　7.侵襲性曲霉菌感染組血清半乳甘露聚糖水平較正常對照組、膿毒血癥組顯著升高。
　　8.侵襲性曲霉菌感染組血清降鈣素原水平、陽性檢出率顯著高于正常對照組，低于膿毒血癥組，侵襲性曲霉菌感染組降鈣素原陽性檢出率明顯低于半乳甘露聚糖陽性檢出率。
　　結(jié)論:
　　1.成功制備生物素化抗體和鏈霉親和素化量子點，抗體生物活性未受明顯影響。
　　2.免疫診斷微

7、球穩(wěn)定性較好，基本符合臨床需要。
　　3.成功創(chuàng)建量子點流式微球技術(shù)定量檢測半乳甘露聚糖方法，方法學(xué)評價良好，符合國際要求，優(yōu)于國內(nèi)ELISA試劑盒;檢測結(jié)果與國內(nèi)半乳甘露聚糖ELISA試劑盒相關(guān)性較好。
　　4.本方法與國外Platelia Aspergillus試劑盒診斷效能相近，診斷效能優(yōu)于國內(nèi)ELISA試劑盒，具有良好的臨床適用性。
　　5.侵襲性曲霉菌感染患者血清降鈣素原水平顯著高于正常體檢者，可進一步拓展降