Real-time PCR檢測(cè)風(fēng)疹病毒方法學(xué)的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、 本文目的是建立一種應(yīng)用于臨床的風(fēng)疹病毒定量檢測(cè)方法；準(zhǔn)確反映體內(nèi)病毒復(fù)制情況，為探討病毒感染量與致病性關(guān)系，以及為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。方法：利用RT-PCR方法擴(kuò)增并回收RV BR1株包膜糖蛋白E1的基因片段，將其與pMD18-T載體連接，經(jīng)氨芐青霉素篩選、酶切鑒定，以獲得RV E1蛋白基因的克隆質(zhì)粒。將此質(zhì)粒用752分光光度儀定量，做對(duì)數(shù)關(guān)系稀釋；以FAM作為熒光指示劑，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)

2、。以不同對(duì)數(shù)關(guān)系的稀釋濃度和相應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)(Ct)為相應(yīng)的X、Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后用我們所建立的方法檢測(cè)19例從臨床收集到的懷疑為風(fēng)疹病毒感染的患者血清標(biāo)本，并將檢測(cè)結(jié)果與經(jīng)典的ELISA方法進(jìn)行比較。結(jié)果指出：本課題所建立的Real-time PCR方法能較好地檢測(cè)出血清中風(fēng)疹病毒的載量，代表了臨床基因檢測(cè)技術(shù)的最新發(fā)展趨勢(shì)，具有較強(qiáng)的敏感性和特異性，且由電腦分析數(shù)據(jù)，結(jié)果客觀，易于判斷，因此有望取代血清學(xué)技術(shù)，成為風(fēng)疹病毒定量