Real-time PCR技術(shù)在結(jié)核病早期診斷中的應(yīng)用.pdf

1、目的： 結(jié)核病仍是造成人類死亡的感染性疾病中最常見病因之一。據(jù)WHO估計，全球約1/3人口感染了結(jié)核分枝桿菌，每年約有八百萬新增病例，有二百萬人死于結(jié)核病。隨著艾滋病的流行，形勢將更加嚴(yán)峻。我國的結(jié)核病疫情相當(dāng)嚴(yán)重，患病人數(shù)之多居世界第二位，是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一?？刂平Y(jié)核病的關(guān)鍵是盡早發(fā)現(xiàn)，隔離和治療活動性肺結(jié)核病人。傳統(tǒng)診斷結(jié)核病的方法主要有涂片染色、培養(yǎng)、胸片及皮膚結(jié)核菌素試驗(yàn)。這些方法已持續(xù)使用了幾十年，但是它們存在靈敏

2、度低特異性差的缺點(diǎn)，阻礙了結(jié)核病的控制。這就迫切要求我們尋求快速、準(zhǔn)確并且簡便的方法。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)以其快速靈敏的優(yōu)點(diǎn)而得到迅速發(fā)展。在結(jié)核病診斷方面，一個主要進(jìn)展是對分枝桿菌菌種的快速鑒定，主要有Gen-Probe公司的Accuprobe基因探針技術(shù)，它明顯縮短了細(xì)菌鑒定時間，但是該技術(shù)必須在培養(yǎng)到分枝桿菌的基礎(chǔ)上進(jìn)行。另一個主要突破是直接從臨床標(biāo)本中檢測結(jié)核分枝桿菌的核酸擴(kuò)增技術(shù)得到了發(fā)展，其中主要有基因探針直接試驗(yàn)(AMT

3、D)、Roche AmpliCOr 結(jié)核分枝桿菌PCR試驗(yàn)(AmpliCor PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)。近來，實(shí)時熒光PCR技術(shù)以其簡單快速的優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷和疾病研究等領(lǐng)域。 本研究以其它多種分枝桿菌檢測技術(shù)結(jié)合臨床診斷為參照，探討熒光PCR技術(shù)在結(jié)核病早期診斷中的應(yīng)用價值。 材料與方法： 540例不同類型臨床標(biāo)本分別用BACTEC MGIT-960系統(tǒng)及羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)，分離得到分

4、枝桿菌分別采用傳統(tǒng)生化法、實(shí)時熒光聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)擴(kuò)增技術(shù)及結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群培養(yǎng)鑒定測試方法(Accuprobe)進(jìn)行菌種鑒定。以 Accuprobe為參照方法評價Real-time PCR和傳統(tǒng)生化法。153例呼吸道標(biāo)本分別進(jìn)行Real-timePCR擴(kuò)增、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群直接擴(kuò)增試驗(yàn)(Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct，AMTD)、抗酸染色和MGIT-

5、960培養(yǎng)，培養(yǎng)所得菌株用Accuprobe方法進(jìn)行菌種鑒定。以培養(yǎng)結(jié)合臨床診斷作為標(biāo)準(zhǔn)評價AMTD和Real-time PCR。 結(jié)果： 1.540例不同類型臨床標(biāo)本經(jīng)MGIT-960培養(yǎng)分離到153株分枝桿菌，初代分離率28.3％，平均檢測時間為10.5±3.3天；羅氏培養(yǎng)法分離到104株分枝桿菌，初代分離率19.3％，平均檢測時間為26.1±5.6天。 2.對153株分枝桿菌進(jìn)行菌種鑒定，Accuprobe

6、方法檢測到結(jié)核分枝桿菌127株，檢測時間為2小時；Real-time PCR方法檢測到結(jié)核分枝桿菌127株，檢測時間為2小時；傳統(tǒng)生化法檢測到123株結(jié)核分枝桿菌，平均檢測時間為28.2±4.8天。與Accuprobe方法相比較， Real-time PCR技術(shù)的靈敏度和特異性均為100％。 3.153例呼吸道標(biāo)本Real-time PCR方法直接檢測陽性68例，陰性85例；AMTD檢測陽性73例，陰性80例；抗酸染色陽性70例

7、，陰性83例； MGIT-960培養(yǎng)分離到77株分枝桿菌，經(jīng)Accuprobe鑒定結(jié)核分枝桿菌69株。與MGIT-960培養(yǎng)結(jié)合Accuprobe鑒定結(jié)果比較Real-time PCR法和Gen-probe AMTD方法的靈敏度分別為90.8％和94.5％，特異性分別為92.7％和90.5％。 4.以培養(yǎng)結(jié)合臨床資料作為標(biāo)準(zhǔn)，153份臨床標(biāo)本中75例被確認(rèn)為陽性。MGIT-960培養(yǎng)、Real-time PCR和AMTD方法的靈

8、敏度分別為92.6％、91.5％、和94.9％；特異性分別為100％、100％和97.2％；陽性預(yù)測值分別為100％、100％和97.3％；陰性預(yù)測值分別為92.1％、90.9％和94.4％。 結(jié)論： Real-time PCR方法在分枝桿菌菌種鑒定及直接檢測呼吸道標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌均具有快速、靈敏特異的優(yōu)點(diǎn)。MGIT-960培養(yǎng)結(jié)合Real-time PCR鑒定，以及Real-timePCR直接檢測呼吸道標(biāo)本，可以使結(jié)