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文檔簡介
1、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)和創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)是引發(fā)食源性疾病的重要病原菌。研究數(shù)據(jù)表明,50%~70%N食用海產(chǎn)品引發(fā)的腹瀉病例是由副溶血弧菌引起的。創(chuàng)傷弧菌通過進食生的牡蠣穿過胃腸道黏膜或通過破損的皮膚接觸海水入血而感染,并在短時間內(nèi)出現(xiàn)敗血癥和蜂窩組織炎、出血性大皰,一旦出現(xiàn)敗血癥,其死亡率高達(dá)60%。因此,副溶血弧茵和創(chuàng)傷弧菌對人的健康是一種潛在危險,檢查食品中副溶血
2、弧菌和創(chuàng)傷弧菌及數(shù)量具有重要的實際意義。 熒光定量PCR技術(shù)根據(jù)熒光能量傳遞原理,融合了PCR技術(shù)的高效擴增、探針技術(shù)的高特異性、光譜技術(shù)的高敏感性和高精確性等優(yōu)點,可直接探測PCR過程中熒光信號的變化獲得定量結(jié)果。根據(jù)熒光定量PCR多通道激發(fā)光源,多個濾光片的檢測體系以及標(biāo)記不同熒光染料的探針,可達(dá)到同時檢測兩種或更多種細(xì)菌的目的,為同步定量檢測食品中的副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌提供了必要的條件。 本文建立了用單一Real-
3、time PCR技術(shù)定量檢測副溶血弧菌和用雙重Real-time PCR技術(shù)同步定量檢測副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌的新方法,并用該方法及傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法對華東地區(qū)海產(chǎn)品中副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌的污染情況進行了調(diào)查。 試驗Ⅰ 從單一Real-time PCR技術(shù)入手,根據(jù)GenBank公布的副溶血弧菌的gyrB基因序列設(shè)計一對引物和TaqMan探針,建立了基于TaqMan探針的Real-timePCR方法。通過對9種細(xì)菌(12株菌株)的DN
4、A進行擴增,結(jié)果所有4株副溶血弧菌均可產(chǎn)生擴增曲線,其他8株非副溶血弧菌均不產(chǎn)生擴增曲線,證明亍引物和探針具有很高的特異性。細(xì)菌純培養(yǎng)液和人工布茵樣品的檢測敏感度分別為1 CFU/PCR反應(yīng)體系和10 CFU/PCR反應(yīng)體系,相關(guān)系數(shù)均為0.99(r<'2>=0.99)。整個試驗可于1h內(nèi)完成。該試驗建立的方法可快速定量檢測海產(chǎn)品種的副溶血弧菌。 試驗Ⅱ 針對副溶血弧菌的gyrB基因序列和創(chuàng)傷弧菌的vvh序列分別設(shè)計引物和Taq
5、Man探針,建立雙重Real-time PCR檢測體系,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,同步定量檢測副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌。建立的雙重Real-time PCR方法對兩種細(xì)菌菌液的檢測敏感度均為10 CFU/PCR反應(yīng)體系,整個試驗可在1 h內(nèi)完成。建立的方法可用于副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌的快速、同步、定量檢測。 試驗Ⅲ對華東地區(qū)海產(chǎn)品中副溶血孤菌和創(chuàng)傷弧菌的污染情況進行了調(diào)查。為了解副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌在我國沿海地區(qū)的分布情況,利用建立的Real-time
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