副溶血弧菌：分子分型與主要耐藥基因雙重PCR檢測.pdf

1、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是一種嗜鹽菌,廣泛分布于海洋環(huán)境及海產(chǎn)品中。該菌能引起人類的食物中毒及各種水生動物疾病。人類食物中毒的癥狀有腹瀉、惡心、嘔吐、發(fā)熱,甚至脫水、昏迷等癥狀。耐熱直接溶血素(TDH),耐熱直接溶血素相關(guān)溶血素(TRH)是公認的副溶血弧菌主要毒力因子,它們與副溶血弧菌的致病能力密切相關(guān)。近年來尿素酶和三型分泌系統(tǒng)的致病力也逐漸受到學者的重視。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中,副溶血弧菌引起的疾病有

2、牡蠣腸炎,蝦紅腿病,蟹大規(guī)模死亡,大黃魚弧菌病等。目前養(yǎng)殖業(yè)普遍使用抗生素治療水生動物弧菌病,過量和濫用藥物已嚴重威脅到我國對外貿(mào)易,養(yǎng)殖業(yè)和人類健康。本研究研究目的是:
　　(1)對攜帶tdh,ureC和T3SS2毒力基因的副溶血弧菌環(huán)境株和臨床株進行分子分型,為建立一個可靠的食品污染溯源體系、深入研究副溶血弧菌分子多樣性提供基礎(chǔ);
　　(2)建立能快速檢測副溶血弧菌主要耐藥基因的PCR方法。為建立副溶血弧菌分子分型與溯源

3、體系,利用多位點序列分型技術(shù)(MLST)對實驗室2003-2009年分離或保存的71株副溶血弧菌臨床株、環(huán)境株和海產(chǎn)品株進行分子分型。
　　結(jié)果表明,7個看家基因分辨率高,均能達到良好的分型效果。71株細菌被歸為62個STs,這62個STs與網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫已有的共計201個STs被分為4個克隆群(Clonal Complexes,CC),18個組(Groups)和141個單型(Singletons)。其中本實驗室54個STs為單型,占

4、總單型的38.3％,其余8個STs分布在2個克隆群和6個組中。進化樹結(jié)果與eBURST結(jié)果基本一致,兩者均證明了副溶血弧菌的分子多態(tài)性。eBURST軟件的分析為追蹤流行菌株及預(yù)測克隆群始祖提供了有力工具。副溶血弧菌CC3群是國際上自1996以來的主要流行菌群,被認為是始祖菌。我國2006-2009年的部分臨床分離株也屬于CC3。在流行性克隆群中,包含了眾多血清型,提示了傳統(tǒng)血清型分型方式的局限性。進化樹分析對不同STs之間的關(guān)系提供了更

5、多細節(jié),在114個STs中的所有菌株形成4個分枝,其中本實驗室的大部分菌株和國內(nèi)外的部分代表性菌株在其中的兩個主要分枝,但有5個STs(分別代表4個菌株)則在另兩個分枝。然而,我們也發(fā)現(xiàn)使用這一MLST分型方法作為食源性疾病發(fā)生時的溯源有其局限性,需要適當考慮毒力基因的序列分析。根據(jù)相關(guān)資料,磺胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類及頭孢類基因為副溶血弧菌攜帶的主要耐藥基因。為建立一種檢測副溶血弧菌主要耐藥基因的快速方法,先通過單一PCR確定陽性菌

6、株與引物對,后優(yōu)化PCR體系條件,建立了兩個雙重PCR體系,分別同時檢測磺胺類和氨基糖苷類,四環(huán)素類和頭孢類耐藥基因。特異性試驗表明不耐藥菌株中檢測不出耐藥基因,敏感性試驗表明只要陽性細菌模板濃度達到105CFU/mL以上,即可出現(xiàn)陽性結(jié)果。應(yīng)用該體系對寧波地區(qū)88株細菌進行耐藥基因的檢測,結(jié)果頭孢類耐藥基因bla TEM的攜帶率為91.7%,四環(huán)素類耐藥基因tetB的檢測率為0,磺胺類sul2和氨基糖苷類strB的檢測率分別為16.7