奶牛布魯氏菌的PCR檢測(cè)與分子分型研究.pdf

1、為了調(diào)查奶牛布魯氏菌病的流行和發(fā)病情況，本研究利用虎紅平板凝集試驗(yàn)(R．BT)和試管凝集試驗(yàn)(SAT)對(duì)浙江省奶牛養(yǎng)殖較為集中的金華地區(qū)30個(gè)奶牛場(chǎng)28243頭奶牛進(jìn)行布魯氏菌病原普查，結(jié)果陽(yáng)性牛1880頭，陽(yáng)性率為6.66﹪。采集布魯氏菌陽(yáng)性的奶牛奶樣570份，通過使用選擇性培養(yǎng)基將奶樣中的細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，分離純化細(xì)菌62株。將純化出的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色、柯茲羅夫斯基鑒別染色和生化試驗(yàn)，50株分離菌株符合布魯氏菌生化指標(biāo)特征。

2、 為了建立從奶品中監(jiān)控布魯氏菌感染的方法，本研究根據(jù)GenBank公布的牛布魯氏菌基因序列設(shè)計(jì)內(nèi)、外向引物，優(yōu)化牛奶樣品中布魯氏菌基因組DNA提取方法，建立了牛奶布魯氏菌套式PCR．方法。結(jié)果顯示，使用人工合成的兩對(duì)布魯氏菌16S rRNA套式引物，通過兩次擴(kuò)增，可有效擴(kuò)增出牛奶中污染布魯氏菌的16S rRNA的特異性DNA片段，其對(duì)牛奶樣品中布魯氏菌檢測(cè)下限達(dá)3.3 CFU/ml，與細(xì)菌分離鑒定方法的吻合率為100﹪，與大腸桿菌、溶

3、血性鏈球菌、沙門氏菌、克雷伯氏桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和螺旋桿菌之間不存在交叉反應(yīng)。這些結(jié)果顯示，本試驗(yàn)建立的布魯氏菌套式PCR檢測(cè)方法具有高度的特異性和敏感性，適用于布魯氏菌的實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)。 對(duì)奶牛布魯氏菌的分子分型進(jìn)行探索。根據(jù)編碼布魯氏菌36kDa外膜蛋白的omp2基因多態(tài)性設(shè)計(jì)引物，利用PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上軟件BI,AST序列比對(duì)分析，51株菌中43株為B．a(chǎn)bortus，8株為B．mil

4、litensis；利用布魯氏菌omp2多態(tài)性只能分出布魯氏菌的種，而不能區(qū)分具體種的生物型。轉(zhuǎn)座因子IS711在不同種布魯氏菌中存在插入位置的多態(tài)性，具有種屬特異性，設(shè)計(jì)IS711通用特異性引物和B．a(chǎn)bortus、丑melitensis、B．ovis、B．suis四個(gè)特異下游配對(duì)引物，以及可以擴(kuò)增B．a(chǎn)bortus5、6、9和3b型的引物DEL569構(gòu)成AMOS-PCR，對(duì)51株布魯氏菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果鑒定B．a(chǎn)bortus5、6、9或