TIPE3的表達(dá)特點(diǎn)及其對腫瘤細(xì)胞生存和遷移的影響.pdf

1、研究目的
　　已知癌基因和抑癌基因在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，發(fā)現(xiàn)新的癌基因或抑癌基因?qū)δ[瘤的診斷或治療有潛在的價值。TIPE(tumornecrosisfactor-α-inducedprotein8，TNFAIP8)家族是近幾年新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)的一組基因，由TIPE、TIPE1、TIPE2和TIPE3組成，它們具有高度同源性，均包含有7個保守的α螺旋（α0-α6）結(jié)構(gòu)，已有研究結(jié)果提示TIPE、TIPE1和TIPE2在

2、多種腫瘤中發(fā)揮癌基因或抑癌基因樣作用，但作為TIPE家族的新成員-TIPE3的特性和在腫瘤中的作用尚未見報道。
　　為了研究TIPE3的表達(dá)特點(diǎn)和在腫瘤中的可能作用，本課題制備了人TIPE3的多克隆抗體并對其特異性進(jìn)行鑒定;然后通過免疫組化的方法，利用所制備的抗體及正常組織芯片和常見腫瘤芯片，分析了TIPE3在人正常組織、腫瘤組織的表達(dá)譜;并對TIPE3表達(dá)有明顯差異的兩種腫瘤-非小細(xì)胞肺癌和食道癌進(jìn)行重點(diǎn)研究，分析了TIPE3在

3、癌和癌旁表達(dá)的差異及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系;最后，在體外，利用所構(gòu)建的長、短及截斷三種人TIPE3表達(dá)載體檢測其對腫瘤細(xì)胞惡性行為（細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移）的影響，初步結(jié)果提示TIPE3具有癌基因樣的作用。
　　實(shí)驗方法:
　　1.標(biāo)本:①人正常組織芯片:含有肝、肺、腎等18種個人正常組織;②多種腫瘤芯片:含有肺癌、食道癌和肝癌等10種腫瘤組織和相應(yīng)的癌旁組織，每種3例;③非小細(xì)胞肺癌及癌旁組織芯片（58例）④食道癌及其

4、癌旁組織芯片（29例）。
　　2.人TIPE3真核表達(dá)載體的構(gòu)建:以人TIPE3基因的克降載體(pFL-B02cl)為模板，設(shè)計不同引物通過PCR得到相應(yīng)目的片段并將其插入到pflag-cmv-2載體中，分別得到長(long-TIPE3)、短(short-TIPE3)和N末端截斷(truncated-TIPE3)TIPE3重組載體。
　　3.TIPE3多克隆抗體的制備:設(shè)計并合成抗原表位，與載體和佐劑混合后，多次免疫家兔制備

5、兔抗人TIPE3多克隆抗體。
　　4.WesternBlot檢測:裂解細(xì)胞后收取蛋白，SDS-PAGE電泳，PVDF膜印跡，TIPE2、TIPE3一抗孵育后，ECL顯色檢測蛋白表達(dá)。
　　5、免疫組織化學(xué):所制備兔抗人TIPE3多克隆抗體作為一抗，辣根酶標(biāo)記羊抗兔二抗孵育，DAB顯色檢測芯片組織中TIPE3蛋白的表達(dá)情況。
　　6、細(xì)胞活力檢測(CCK8法):將TIPE3載體轉(zhuǎn)染進(jìn)腫瘤細(xì)胞后，分別于0h、24h、48h

6、和72h通過檢測細(xì)胞線粒體中脫氫酶的甲瓚還原記錄細(xì)胞活力。
　　7.流式細(xì)胞術(shù):細(xì)胞用胰酶消化成單個細(xì)胞后，加入PI染色后，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。
　　8、細(xì)胞遷移檢測（Transwell法）:將空載體或三種TIPE3重組載體轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞24h后，制備單細(xì)胞懸液，置transwell上層，檢測細(xì)胞從上層向下層的遷移能力。
　　9、統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用非參數(shù)秩和檢驗（Wilcoxon檢驗）、卡方檢驗等分別對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計。<

7、br>　　結(jié)果:
　　一.構(gòu)建了含人TIPE3兩個異構(gòu)體（長和短）及N-末端截斷的真核表達(dá)載體
　　人TIPE3有兩個異構(gòu)體-長(292aa)、短(204aa)，短型N末端有一個與TIPE2不同的結(jié)構(gòu)域（這里簡稱N端結(jié)構(gòu)域），我們分別構(gòu)建了三種表達(dá)載體，即長TIPE3載體(long-TIPE3)、短TIPE3載體（short-TIPE3）和N端結(jié)構(gòu)域被截斷的TIPE3載體(truncated-TIPE3)并通過酶切電泳驗證載

8、體構(gòu)建成功。
　　二、TIPE3多克隆抗體制備及其特異性鑒定
　　1、制備了兔抗人TIPE3的多克隆抗體:設(shè)計并合成TIPE3特異性抗原表位，與載體結(jié)合后，多次免疫兔制備兔抗人TIPE3特異性抗體，抗體滴度1∶400。
　　2、TIPE3抗體的特異性分析:為明確所制備抗體的可行性及特異性，我們將人TIPE2、TIPE3載體分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入293細(xì)胞，分別用TIPE2、TIPE3抗體進(jìn)行WesternBlot檢測。結(jié)果顯示在

9、用TIPE2抗體染色時，只在轉(zhuǎn)染TIPE2組可見TIPE2的表達(dá)帶，轉(zhuǎn)染TIPE3及對照組均未顯示有TIPE2條帶;而用TIPE3抗體染色時，只在TIPE3組出現(xiàn)一明顯的條帶，分子量與預(yù)測的基本一致，轉(zhuǎn)染TIPE2及對照組均未見相同大小條帶，說明該條帶即為人TIPE3蛋白的特異性條帶，所制備的TIPE3抗體與TIPE2無交叉反應(yīng)，特異性較高。
　　三、TIPE3在人正常組織中的表達(dá)譜
　?。ㄒ唬┍磉_(dá)部位
　　TIPE3

10、主要分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，胞核未見有TIPE3的陽性表達(dá)。
　?。ǘ┍磉_(dá)特點(diǎn)
　　1.TIPE3在被覆上皮中的表達(dá)情況:由芯片結(jié)果可見，在單層扁平細(xì)胞，如肺泡上皮中，未見TIPE3表達(dá);但在具有分泌功能的胰腺、汗腺和前列腺等導(dǎo)管單層立方上皮細(xì)胞中呈現(xiàn)TIPE3的明顯高表達(dá)，腎小管和膽管上皮細(xì)胞中也明顯高表達(dá)，但甲狀腺單層濾泡上皮細(xì)胞、卵巢及腎上腺細(xì)胞中卻未見其表達(dá);在單層柱狀上皮中，胃、小腸、大腸等黏膜上皮細(xì)胞中可見有TI

11、PE3蛋白明顯高表達(dá)。
　　2.TIPE3在實(shí)質(zhì)器官中的表達(dá)情況:在肝細(xì)胞中可見TIPE3低表達(dá)，而在肌組織（骨骼肌和心?。┘澳X組織（大腦和小腦）細(xì)胞中卻呈現(xiàn)廣泛的高表達(dá)狀態(tài)。
　　四、TIPE3在人腫瘤中的表達(dá)特點(diǎn)及其臨床意義
　　一、TIPE3在腫瘤中的表達(dá)譜-芯片
　　TIPE3在腫瘤中的表達(dá)譜:為了分析TIPE3與腫瘤的可能關(guān)系，我們采用免疫組化的方法，分析了TIPE3在組織芯片上的10種腫瘤的中的表達(dá)，

12、結(jié)果發(fā)現(xiàn)TIPE3某些腫瘤組織中的表達(dá)高于其癌旁組織，提示其與腫瘤的生長代謝密切相關(guān)。
　　二、TIPE3在食道癌中的表達(dá)和臨床意義
　?。ㄒ唬㏕IPE3在癌旁和癌中表達(dá)的差別
　　TIPE3蛋白在食管癌癌組織中的表達(dá)高于相應(yīng)癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.0001)。
　?。ǘ㏕IPE3在食管癌中的表達(dá)與臨床病例資料的相關(guān)性分析
　　將腫瘤芯片中食管癌患者的臨床病理資料進(jìn)行分類整理，發(fā)現(xiàn)隨著食管癌患

13、者腫瘤組織病理分級的增加，TIPE3表達(dá)程度也相對增加。
　　三、TIPE3在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)和臨床意義
　?。ㄒ唬㏕IPE3在癌旁和癌中表達(dá)的差別
　　TIPE3蛋白在非小細(xì)胞肺癌癌組織中的表達(dá)高于其癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.0001)。
　?。ǘ㏕IPE3在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)強(qiáng)度與臨床病例資料相關(guān)性分析
　　我們將芯片中患者的病理資料分別進(jìn)行分類，TIPE3在肺癌組織中表達(dá)的強(qiáng)度與患

14、者年齡、性別和TNM分期均未發(fā)現(xiàn)有明顯的相關(guān)性。
　　（三）TIPE3膜型、漿型表達(dá)及其與臨床病例資料的相關(guān)性分析
　　根據(jù)TIPE3蛋白在肺癌組織中表達(dá)部位的不同，將TIPE3表達(dá)分為漿型和膜型兩種類型，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)膜型TIPE3表達(dá)在T2-T3期患者中所占比例高于T1期患者。
　　第四部分TIPE3對腫瘤細(xì)胞惡性行為的影響
　　一、三組TIPE3質(zhì)粒在腫瘤細(xì)胞(HepG2)中轉(zhuǎn)染效率的檢測
　　為了后續(xù)

15、研究TIPE3對腫瘤細(xì)胞惡性行為的影響，我們首先將三組TIPE3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，收取細(xì)胞蛋白后檢測相應(yīng)TIPE3蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示三組過表達(dá)TIPE3質(zhì)粒細(xì)胞都檢測到相應(yīng)TIPE3蛋白的表達(dá)，即質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率較高。
　　二、TIPE3對腫瘤細(xì)胞增殖的影響
　　為研究TIPE3對腫瘤細(xì)胞生長的影響，我們用長、短和截斷的TIPE3重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞系，于轉(zhuǎn)染后0h、24h、48h及72h用CCK8方法檢測細(xì)胞

16、活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)長型TIPE3對腫瘤細(xì)胞的生長無明顯影響，但短型TIPE3明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，N端截斷后不僅其促細(xì)胞增殖的作用消失，反而出現(xiàn)抑制效應(yīng)，提示短型TIPE3可能在腫瘤中更重要，且N端功能域起關(guān)鍵作用。
　　三、TIPE3對細(xì)胞周期的影響
　　為研究TIPE3對腫瘤細(xì)胞周期的影響，我們將細(xì)胞種板，轉(zhuǎn)染48小時后通過PI染色檢測不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞周期的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染空載體組和TIPE3載體組細(xì)胞相比，細(xì)胞周期未見有

17、明顯改變。
　　四、TIPE3對細(xì)胞遷移的影響
　　為研究TIPE3對腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響，我們用長、短和截斷TIPE3重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染24小時后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到transwell小室，分析細(xì)胞遷移能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)果長型TIPE3對細(xì)胞的遷移能力沒有明顯的影響，但短型TIPE3明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，N端截斷后其促細(xì)胞遷移的作用消失。說明短型TIPE3具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移的作用，且N端功能域起關(guān)鍵作用。<

18、br>　　結(jié)論
　　1、成功制備了兔抗人TIPE3的特異性多克隆抗體，其與人同家族TIPE2蛋白之間沒有交叉反應(yīng)。
　　2、人TIPE3在正常組織中有較廣泛的分布，主要高表達(dá)于立方上皮和柱狀上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞及腦細(xì)胞中;在腫瘤組織中的表達(dá)因組織類型的不同而有所差異;在非小細(xì)胞肺癌及食道癌癌組織中的表達(dá)明顯高于其相應(yīng)癌旁組織，提示在這兩種腫瘤中發(fā)揮更重要的作用。
　　3、短型人TIPE3具有癌基因樣作用，它的過表達(dá)可明顯促

19、進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力，其N端結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涔δ苁潜仨毜摹ｉL型TIPE3作用不明顯。
　　創(chuàng)新性及意義
　　1、首次制備了特異性抗體，明確TIPE3分別在人多種正常組織及腫瘤組織（特別是在肺癌和食道癌）中的表達(dá)特點(diǎn)，為TIPE3的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　2、通過臨床標(biāo)本和體外實(shí)驗初步確定短型人TIPE3具有癌基因樣作用，其N端功能域是其功能所必須的，而長型作用不明顯，以上為研究TIPE3在腫瘤中的作用和機(jī)制提供了線索