布拉氏酵母菌對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠非酒精性脂肪性肝炎的療效及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD)是指除乙醇和其他明確的肝損傷因素外，以彌漫性肝大泡性脂肪變、伴或不伴炎癥為主要特征的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化以及肝硬化。非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)是單純性脂肪肝發(fā)展成為肝纖維化及肝硬化的必經(jīng)途徑。
　　 近年隨著研究的不斷深入.由小腸細(xì)菌過度生長(zhǎng)

2、(smallintestinalbacterialovergrowth，SIBO)、細(xì)菌易位、腸黏膜通透性改變等所致的腸源性內(nèi)毒素血癥(intestinalendotoxemia，IETM)在NASH病程中起到了關(guān)鍵作用。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁外層的主要成分，也稱脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，是肝損傷中的一個(gè)重要因子，主要與釋放的炎性細(xì)胞因子和介質(zhì)有關(guān)，它能激發(fā)機(jī)體引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)單純性脂肪肝向非

3、酒精性脂肪性肝炎進(jìn)展。宿主細(xì)胞膜上的模式識(shí)別受體是介導(dǎo)細(xì)胞識(shí)別LPS，并啟動(dòng)LPS反應(yīng)的首要環(huán)節(jié)。LPS與白細(xì)胞分化抗原14（Clusterofdifferentiation14，CD14）和Toll樣受體4(Toll-likereceptor4，TLR4)相互作用產(chǎn)生跨膜信號(hào)引起LPS介導(dǎo)的細(xì)胞激活，從而通過LPS-CD14-TLR4信號(hào)通路誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子包括TNF-α、IL-1、IL-6、NO等的大量表達(dá)，進(jìn)而損傷肝臟。
　

4、　 布拉氏酵母菌是一類益生菌，可以維持腸道微生物的平衡，抑制腸源性內(nèi)毒素的產(chǎn)生，促進(jìn)體內(nèi)內(nèi)毒素向腸腔轉(zhuǎn)移，加速內(nèi)毒素的排泄，減少內(nèi)毒素對(duì)肝臟的刺激，使CD14、TLR4表達(dá)減低，最終減少促炎性細(xì)胞因子的分泌和釋放，起到保護(hù)肝臟的作用。因此，我們擬通過研究布拉氏酵母菌干預(yù)下非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝組織CD14、TLR4表達(dá)的變化，進(jìn)一步探討益生菌在治療非酒精性脂肪性肝病中的機(jī)制，從而以利于臨床合理開展非酒精性脂肪性肝病治療和防治工作。<

5、br>　　 目的:高脂飲食構(gòu)建非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型，測(cè)定血清內(nèi)毒素的水平，以及該過程中布拉氏酵母菌對(duì)大鼠肝組織CD14、TLR4表達(dá)的影響，探討布拉氏酵母菌對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠非酒精性脂肪性肝炎的療效及其可能的作用機(jī)制。
　　 方法:42只雄性SD大鼠，體重180±20g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為如下3組:①Control組14只，給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng);②Model組14只，給予高脂飼料喂養(yǎng)（88％普通飼料+2％膽固醇+10％豬油）

6、;③Treatment組14只，給予高脂飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均分籠（每籠4只）飼養(yǎng)于25±2℃、明暗各12h的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，自由飲水進(jìn)食。于喂飼16周末各組隨機(jī)處死4只，行肝組織HE染色確定非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型成功。自17周開始治療組給予布拉氏酵母菌散劑（78*108CFU/kg·d-1）灌胃，正常對(duì)照組及模型組給予等容量蒸餾水灌胃。每周記錄動(dòng)物體重1次，根據(jù)體重變化調(diào)節(jié)灌胃計(jì)量，連續(xù)進(jìn)行至24周末給藥期結(jié)束，處死全部大鼠。

7、　　 觀察肝臟的大體情況，并完整切除肝臟，稱肝臟濕重;采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶，谷草轉(zhuǎn)氨酶和甘油三酯;采用鱟試劑法測(cè)定血清內(nèi)毒素水平;采用HE染色觀察肝臟病理變化;采用免疫組織化學(xué)方法觀察肝組織CD14、TLR4蛋白的表達(dá)情況;采用熒光定量PCR(realtimefluores-cencequantitativePCR，RTFQPCR)方法測(cè)定肝組織CD14mRNA、TLR4mRNA的水平。
　　 結(jié)果:①喂飼1

8、6周末時(shí)，對(duì)部分大鼠肝組織行HE染色:高脂飲食的大鼠出現(xiàn)肝臟脂肪變、氣球樣變及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，明確證實(shí)給予高脂飲食成功復(fù)制了NASH大鼠模型。②大鼠體重、肝濕重及肝指數(shù)(肝濕重/體重×100％):24周末時(shí)稱重，模型組大鼠的體重（567.60±18.89）、肝重（19.68±2.68）、肝指數(shù)（3.47±0.43）均明顯高于正常對(duì)照組的體重(460.71±14.71)、肝重（11.53±0.98）及肝指數(shù)（2.5±0.12）(P＜0.05

9、)。與模型組相比，治療組體重（521.50±19.40）、肝重(15.06±1.32)及肝指數(shù)(2.89±0.20)均明顯降低(P＜0.05)。③血清生化指標(biāo):模型組ALT(103.44±8.41)較正常對(duì)照組(39.10±9.37)顯著增高(P＜0.05)，與模型組相比，治療組ALT(71.03±7.98)明顯降低(P＜0.05);模型組AST(276.95±25.06)，較正常對(duì)照組(145.37±15.19)顯著增高(P＜0.05

10、)，與模型組相比，治療組AST(191.68±14.62)明顯降低(P＜0.05）;模型組TG(0.93±0.14)較正常對(duì)照組(0.54±0.10)顯著升高(P＜0.05)，治療組TG(0.73±0.11)較模型組明顯下降(P＜0.05);④模型組血清內(nèi)毒素水平（0.3600±0.0293）顯著高于正常對(duì)照組（0.12±0.05）(P＜0.05），與模型組相比，治療組血清內(nèi)毒素水平（0.2226±0.0156）明顯降低(P＜0.05)

11、。⑤肝臟病理學(xué)改變:16周末大鼠肝組織HE染色顯示，正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)均無脂肪變性及氣球樣變，部分大鼠肝組織內(nèi)可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);給予高脂飲食的模型組大鼠肝組織均可見大泡性和小泡性混合型脂肪空泡，彌漫性的肝細(xì)胞脂肪變性，部分氣球樣變肝細(xì)胞周圍伴有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。隨著造模時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，模型組大鼠肝臟脂肪變程度越來越明顯，24周末脂肪變程度較前明顯加重，以重度為主，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)充滿大量脂肪空泡，還可見到程度不等的小葉內(nèi)炎癥，匯管區(qū)

12、炎癥及點(diǎn)灶狀壞死，NAS炎癥評(píng)分與正常組相比有顯著性差異(P＜0.05)。與模型組相比，治療組NAS炎癥評(píng)分較模型組明顯改善（P＜0.05）。⑥免疫組化顯示，正常對(duì)照組肝組織低表達(dá)CD14(0.0735±0.0134)、TLR4(0.0764±0.0189);模型組肝組織CD14（0.2118±0.0399）、TLR4表達(dá)(0.2151±0.0167)較對(duì)照組顯著增強(qiáng)(P＜0.05）;治療組CD14（0.1435±0.0604）、TLR

13、4（0.1538±0.0257）較模型組明顯減低(P＜0.05）。⑦應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)分析，正常對(duì)照組肝組織低表達(dá)CD14mRNA（0.4529±0.2439）、TLR4mRNA(0.9049.±0.1135);模型組肝組織CD14mRNA（1.5315±0.2527）、TLR4mRNA(2.4198±0.2289)較正常對(duì)照組顯著增強(qiáng)(P＜0.05）;治療組CD14mRNA（0.9967±0.2981）、TLR4mRNA（1.69