急性缺血腦組織靶向肽的篩選、鑒定及分子成像研究.pdf

1、急性缺血性腦卒中能夠引發(fā)大腦神經(jīng)組織的一系列應(yīng)激反應(yīng)，包括酸中毒、興奮性氨基酸釋放、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基釋放、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，這些應(yīng)激反應(yīng)的進展通常反應(yīng)腦卒中的病理進程。準(zhǔn)確評價腦缺血后某一時期應(yīng)激反應(yīng)進展，實現(xiàn)其定位、定性、定量及可視化，對于評估腦損傷與修復(fù)、指導(dǎo)腦卒中的個體化治療和預(yù)測病人預(yù)后具有重要的意義。分子影像技術(shù)能夠通過特異性的分子探針從活細(xì)胞水平實現(xiàn)特定分子的可視化和定量研究，可用于腦缺血后病理進程的監(jiān)測。但現(xiàn)有的可

2、用于腦卒中分子成像的特異性分子探針報道并不多見，限制了分子影像技術(shù)的應(yīng)用。本研究通過噬菌體展示肽庫體內(nèi)篩選技術(shù)，以期獲得能夠靶向缺血腦組織的多肽，并構(gòu)建分子探針，初步實現(xiàn)缺血腦卒中的分子成像，主要實驗結(jié)果如下:
　　1、急性缺血腦組織靶向分子的體內(nèi)篩選
　　通過線栓法構(gòu)建小鼠右側(cè)大腦中動脈阻塞(MCAO)模型，模擬人類急性缺血性腦卒中。通過噬菌體展示七肽庫對MCAO小鼠進行體內(nèi)篩選，經(jīng)四輪篩選后噬菌體克隆在MCAO小鼠缺血側(cè)

3、腦組織的密度較第一輪篩選時富集了10.4倍。從第四輪篩選所回收噬菌體克隆中隨機挑選120個分隔良好的藍(lán)色噬菌斑進行擴增培養(yǎng)后，提取DNA測序，最終成功測序106個噬菌體克隆，共得到17種序列，其中多肽序列HGGVRLY出現(xiàn)頻次最高，占有絕對優(yōu)勢，將其命名為HGG肽，展示有該肽的噬菌體克隆命名為HGG-M13噬菌體，作為候選噬菌體用于后續(xù)實驗。
　　2、HGG-M13噬菌體肽及HGG肽靶向缺血腦組織的特異性鑒定
　　本研究首先

4、從HGG-M13噬菌體的角度，通過噬菌體體內(nèi)回輸實驗和免疫熒光實驗鑒定HGG-M13噬菌體能夠靶向缺血腦組織，而且這種靶向性依賴于噬菌體表面展示的HGG肽而不是噬菌體自身的骨架蛋白;免疫熒光雙標(biāo)實驗結(jié)果提示HGG-M13噬菌體與缺血腦組織中部分神經(jīng)元共定位。
　　隨后，分別采用5-TAMRA和FITC兩種熒光基團修飾HGG肽，并注射至MCAO小鼠體內(nèi)，HGG熒光肽主要集中在缺血側(cè)腦組織，與HGG-M13噬菌體結(jié)果相一致，再次提示H

5、GG肽能夠靶向缺血腦組織。此外，通過體外培養(yǎng)神經(jīng)元，構(gòu)建氧糖剝奪模型，并用HGG熒光肽與之孵育，結(jié)果提示HGG熒光肽能夠與氧糖剝奪后的神經(jīng)元結(jié)合。
　　3、基于HGG肽構(gòu)建急性腦缺血靶向分子探針及初步分子成像
　　在EDC/Sulfa-NHS活化下，HGG肽上的氨基與錳鋅鐵氧體納米顆粒表面所攜帶的羧基發(fā)生縮合反應(yīng)，使得錳鋅鐵氧體納米顆粒表面修飾HGG肽，從而構(gòu)建得到分子探針，并對其表征:電鏡尺寸大小為15.17 nm，水合粒

6、徑為53.98 nm，r2弛豫率為382.45mM-1S-1。將該分子探針注射至MCAO小鼠體內(nèi)，通過磁共振成像檢測到該分子探針的信號主要聚集在大腦缺血側(cè)，而未經(jīng)HGG肽修飾的錳鋅鐵氧體對照探針則無信號。
　　綜上所述，本研究通過噬菌體展示肽庫篩選技術(shù)對MCAO小鼠進行體內(nèi)篩選，得到能夠靶向缺血腦組織的HGG肽，并初步鑒定了該肽的靶細(xì)胞為缺血狀態(tài)下的神經(jīng)元?；谠撾臉?gòu)建了磁共振成像分子探針，磁共振成像顯示該分子探針能夠在MCAO小