噬菌體展示技術(shù)經(jīng)鼻篩選腦靶向肽.pdf

1、目的：利用噬菌體肽庫(kù)展示技術(shù)篩選能夠與大腦特異性結(jié)合的特異性噬菌體，選擇幾個(gè)代表性的單克隆進(jìn)行測(cè)序，最后合成一條最有特異性的單克隆噬菌體所展示的短肽，并進(jìn)一步探討合成短肽的腦靶向性以及繞過(guò)血腦屏障到達(dá)大腦的可能途徑。 方法：使用含有7個(gè)氨基酸的Ph.D.-C7C噬菌體展示肽文庫(kù)，進(jìn)行三輪高通量的體內(nèi)生物篩選步驟。進(jìn)行每一輪篩選時(shí)，噬菌體從鼻腔給予，45分鐘后，分離大鼠大腦組織，俘獲腦組織中的噬菌體，進(jìn)行滴度測(cè)定。經(jīng)過(guò)三輪富集后，

2、挑取十個(gè)陽(yáng)性單克隆噬菌體進(jìn)行測(cè)序，并選擇其中一個(gè)最富代表性的噬菌體，合成其所展示的短肽。然后通過(guò)序列特異性比較實(shí)驗(yàn)、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)、免疫組化和免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該克隆噬菌體及其攜帶的短肽的腦靶向性。 結(jié)果：經(jīng)過(guò)三輪篩選后，大腦中的噬菌體逐漸富集。7號(hào)單克隆噬菌體與C7C庫(kù)噬菌體、隨機(jī)噬菌體分別鼻腔給予后，腦組織中的噬菌體數(shù)量總體上存在明顯差異(P<0.01)；7號(hào)單克隆噬菌體鼻腔給予后，大腦分別與血液、脾臟、肝臟之間比較，都有顯

3、著性差異(P’s<0.01)；不同量的NB-101肽(naso-brain-101peptide，即7號(hào)單克隆噬菌體所展示的短肽)和對(duì)照肽分別與7號(hào)單克隆噬菌體同時(shí)鼻腔給予后，前者大腦中的噬菌體數(shù)量明顯少于后者(P<0.01)；7號(hào)單克隆噬菌體鼻腔給予后，分別取大腦與脾臟、肝臟進(jìn)行免疫熒光組化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腦中可見(jiàn)很多紅色熒光點(diǎn)(陽(yáng)性)，而肝臟和脾臟中都陰性；FITC-NB-101肽與對(duì)照肽(FITC-TD-1)分別鼻腔給予后，分離嗅神經(jīng)

4、，固定、脫水、切片后在熒光顯微鏡下不同時(shí)間點(diǎn)(1秒、3秒、5秒及7秒)曝光，發(fā)現(xiàn)FITC-NB-101肽的熒光明顯強(qiáng)于對(duì)照組。 結(jié)論：通過(guò)鼻腔給予噬菌體，經(jīng)過(guò)三輪的篩選，噬菌體得到了明顯的富集，得到了特異性最強(qiáng)的單克隆噬菌體(與大腦表面特異性結(jié)合)—即7號(hào)單克隆噬菌體，序列上和組織上都存在特異性。7號(hào)單克隆噬菌體所展示的短肽(NB-101肽)人工合成后，具有一定的腦靶向性，可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制噬菌體進(jìn)入大腦組織。并且在嗅神經(jīng)中大量富集