多價噬菌體分離篩選及靶向滅活

1、1 多價 多價噬菌體 噬菌體分離篩選及 分離篩選及靶向滅活 靶向滅活 土壤 土壤病原菌 病原菌的應(yīng)用 應(yīng)用研究 研究? 趙遠(yuǎn)超 1,2，葉茂 2?，夏冰 3，焦文濤 4，馮彥房 5，都瑞軍 6， 杜道林 6，張忠云 2，黃丹 2，孫明明 1，武俊 1，胡鋒 1，蔣新 2，杜良成 7 （1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，土壤生態(tài)實驗室，南京 210095） （2 中國科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點實驗室(中國科學(xué)院南京土壤研究所)，南京

2、210008） （3 安徽省環(huán)境科學(xué)研究院，合肥 230022） （4 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室，北京 100085） （5 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，南京 210014） （6 江蘇大學(xué)環(huán)境安全工程學(xué)院，環(huán)境生態(tài)研究所，鎮(zhèn)江，212013） （7Nebraska 大學(xué)-Lincoln 校區(qū)，化學(xué)系，美國，68588） 摘 要 農(nóng)田土壤中殘留和滋生多種病原菌會對人體健康和生態(tài)環(huán)境帶來顯著的

3、安全隱患，開展針對性的生物修復(fù)研究十分迫切。噬菌體療法靶向滅活土壤中病原菌的技術(shù)為修復(fù)此類污染土壤提供了全新途徑。本研究以南京城郊某奶牛場牛糞堆積池周邊，糞腸桿菌和假單胞菌復(fù)合污染農(nóng)田土壤為例，首先篩選和純化獲得兩株專一型噬菌體（YSZ1 和 YSZ5） ，再人為加速其宿主譜的表達(dá)過程，獲得對應(yīng)的多價噬菌體（YSZ1R 和 YSZ5K） ，并進(jìn)行生物學(xué)特性（形態(tài)、核酸、最佳感染復(fù)數(shù)、一步生長曲線等）鑒定，發(fā)現(xiàn)：在水相和污染土壤中不同噬菌

4、體對于同步滅活病原菌的能力依次是 YSZ5K＞YSZ1R＞YSZ5＞YSZ1，并且施用多價噬菌體療法有助于維護(hù)和改善修復(fù)后土壤微生物生態(tài)功能多樣性與穩(wěn)定性。本研究結(jié)果可為噬菌體療法靶向滅活土壤中多種病原菌提供切實可行的修復(fù)技術(shù)。 關(guān)鍵詞 病原菌；土壤；噬菌體療法；靶向滅活 中圖分類號 S154.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 由于我國現(xiàn)階段畜禽糞便安全化處理技術(shù)或環(huán)境管理仍存在一定的不足或缺失， 許多城郊

5、畜牧業(yè)養(yǎng)殖廠周邊的農(nóng)田土壤常成為殘留和滋生人畜共患病原菌的高風(fēng)險熱點區(qū)域， 嚴(yán)重影響人體健康和環(huán)境安全[1]。因而，針對病原菌污染農(nóng)田土壤，開展必要的生物修復(fù)技術(shù)研? 2017 年度江蘇省環(huán)保科研課重點項目（2017005）、2017 年江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項 （CX(17)3047）、中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會（2018350）、國家自然科學(xué)基金面上項目（41771350）資助 ? 通訊作者，E-mail：yemao@issas

6、.ac.cn 作者簡介：趙遠(yuǎn)超（1993-） 男 黑龍江省齊齊哈爾市 碩士研究生 主要從事噬菌體分離純化、定向進(jìn)化及農(nóng)業(yè)噬菌體療法在致病細(xì)菌污染土壤中的靶向滅活研究 E-mail: 2016103027@njau.edu.cn 收稿日期： 年-月-日；收到修改稿日期： 3 保存的噬菌體（YSZ1 或 YSZ5）原液，分別與 200 μl K12 和 200 μl PAO1(RFP)混合菌懸液，共同加入 99 ml LB 液體培

7、養(yǎng)基中，再加入氯化鈣固體調(diào)至終濃度為 1 mmol L-1，37℃，150 rpm 振蕩培養(yǎng) 96 h， 每隔 8 h 取樣， 將離心過濾獲得的新噬菌體與 PAO1（RFP）和 K12 分別倒雙層平板驗證，觀察噬菌斑。若出現(xiàn)噬菌斑則證明表達(dá)成功，獲得多價噬菌體 YSZ1R 和YSZ5K，挑取單個清晰透明的噬菌斑富集儲存。 1.3 噬菌體的生物學(xué)特性鑒定 噬菌體的形態(tài)觀察，將噬菌體原液滴在銅網(wǎng)上，用 pH 7.0，2%磷鎢酸負(fù)染 90 s

8、 后，用濾紙吸去多余染液，干燥后于日立 H-7650 型透射電子顯微鏡下觀察其形態(tài)。 噬菌體核酸提取及鑒定， 噬菌體核酸提取使用環(huán)境樣品病毒核酸提取試劑盒 （核酸提取效率 107 copies mL-1，核酸最終體積 50～100 μl） ，提取的核酸用 DNaseⅠ、RNaseⅠ和 Hind Ⅲ酶切處理并使用瓊脂糖凝膠電泳檢驗，根據(jù)酶切圖譜鑒定和判斷其核酸性狀及大小。 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)，感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of In

9、fection，MOI）又稱作噬菌體滴度，是指感染發(fā)生之前噬菌體與宿主菌數(shù)量的比值。最佳感染復(fù)數(shù)（Optimal Multiplicity of Infection，OMOI）即獲得子代噬菌體最高產(chǎn)量時的 MOI。取對數(shù)期宿主菌懸液 100 μl，按感染復(fù)數(shù)分別為 100?1、10?1、1?1、1?100、1?1 000、1?10 000 加入噬菌體。37℃搖床振蕩培養(yǎng) 5 h。用雙層平板法測定各組噬菌體滴度。 噬菌體一步生長曲線， 按

10、最佳感染復(fù)數(shù)， 取 500 μl 噬菌體與 500 μl 宿主菌懸液加入 9 ml LB 液體培養(yǎng)基中，37℃，150 rpm 振蕩培養(yǎng)，每 10 min 取樣，離心過濾，并用雙層平板法測定噬菌體滴度[14]。 1.4 試驗設(shè)計 噬菌體對宿主菌的滅活能力， 驗證上述分離獲得的噬菌體對宿主菌的滅活能力， 按照最佳感染復(fù)數(shù)添加噬菌體與宿主菌各 100 μl 于 100 ml LB 液體培養(yǎng)基中，37℃，150 rpm 振蕩培養(yǎng)。每隔 2 h

11、 取樣，每次取 200 μl 稀釋適當(dāng)濃度，平板計數(shù)細(xì)菌數(shù)量。每個處理同時設(shè)置單獨不添加噬菌體的對照。 噬菌體療法在水相中滅活病原菌的效果 ， 設(shè)置水相對照組 （CK） ， 即： 將 K12 與 PAO1(RFP)培養(yǎng)到對數(shù)期后，各取 100 μl 加入 100 ml LB 液體培養(yǎng)基中，振蕩混勻，37℃，150 rpm 振蕩培養(yǎng)。在 CK 基礎(chǔ)上,綜合參考最佳感染復(fù)數(shù)，再設(shè)立四個處理，分別是處理 1：添加專一型噬菌體 YSZ1；處理

12、 2：添加多價噬菌體 YSZ1R；處理 3；添加專一型噬菌體 YSZ5；處理 4：添加多價噬菌體 YSZ5K。每種噬菌體均添加 100 μl（104 PFU mL-1） ，每隔 4 h 取樣，共監(jiān)測 48 h，每次取 200 μl 菌懸液進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)。根據(jù)細(xì)菌平板計數(shù)判斷評估噬菌體療法在水相中對病原菌的滅活效果。 噬菌體療法在污染土壤中的滅活驗證研究， 為進(jìn)一步驗證噬菌體療法在實際污染土壤中滅活多種病原菌的效果， 本環(huán)節(jié)將進(jìn)行逐一回接上

13、述分離獲得的噬菌體至污染土壤中， 開展修復(fù)驗證實驗。重點關(guān)注土壤中糞腸桿菌（Fecal Coliform）和假單胞菌屬（Pseudomonas）菌群等病原菌的滅活效果。共設(shè)置 5 個實驗處理， 分別是對照組（CK） ：稱 250 g 污染土壤，每隔 8 天以無菌水調(diào)控土壤含水率至最大田間持水量的 80 %，28℃± 4℃，避光培養(yǎng) 24 天；處理 1：在對照組基礎(chǔ)上添加專一型噬菌體 YSZ1；處理 2：在對照組基礎(chǔ)上添加多價噬

14、菌體 YSZ1R；處理 3：在對照組基礎(chǔ)上添加專一型噬菌體 YSZ5；處理 4：在對照組基礎(chǔ)上添加多價噬菌體 YSZ5K。每組處理均添加噬菌體 500 μl（104 PFU mL-1） 。每隔 3 天取樣，每次取 5 g 土壤，平板計數(shù)法測定細(xì)菌數(shù)量。使用 ECD 培養(yǎng)基篩選并測定糞腸桿菌群細(xì)菌數(shù)目，使用 PSA 培養(yǎng)基篩選并測定假單胞菌群細(xì)菌數(shù)目，每個計數(shù)濃度設(shè) 3 次重復(fù)。 1.5 土壤微生物群落功能的多樣性和穩(wěn)定性分析 將 1